Aula #11 - Hidrólise Ácida e Enzimática do Amido

Understanding Starch Degradation

Introduction to Starch and Its Composition

• The previous lesson covered the polysaccharide composition of starch, including methods for identifying starch through color reactions and precipitation techniques.

• Today's focus is on two forms of starch degradation: chemical and enzymatic, highlighting important differences in their mechanisms and final products.

Enzymatic Degradation of Starch

• Starch consists of a mixture of two homopolysaccharides: amylose (linear) and amylopectin (branched).

• Amylases are specialized enzymes that degrade starch. There are different types, including alpha-amylase (salivary and pancreatic), which act by breaking glycosidic bonds within the molecule.

• Alpha-amylase specifically recognizes a sequence of six glucose units linked by α(1→4) glycosidic bonds, initiating carbohydrate digestion in the body.

Products of Enzymatic Hydrolysis

• The action of alpha-amylase on starch produces maltose, a disaccharide formed from two glucose units linked by α(1→4).

• If alpha-amylase acts on amylose with 1000 glucose units, it yields approximately 500 maltose molecules as products.

• When acting on amylopectin, alpha-amylase cleaves at specific points but cannot hydrolyze all linkages due to its active site limitations.

Chemical Hydrolysis of Starch

• Complete degradation can also occur via acid hydrolysis using strong acids at high temperatures. This method does not differentiate between types of glycosidic bonds.

• Acid hydrolysis randomly breaks down both amylose and amylopectin into free glucose units; for example, 1000 glucose units yield 1000 free glucose molecules after complete hydrolysis.

Experimental Methodology

• Today's experiments will test both methodologies for starch degradation using various reaction conditions over time.

• Two colorimetric reactions will be employed: one to detect the presence of starch (iodine reaction), and another to identify reducing sugars (DNS reaction).

• Multiple samples will be collected at different times during the experiments to analyze the presence of starch and reducing sugars under both conditions.

Conclusion

Calibration Curve for Reducing Sugars

Introduction to Calibration Curve

• The process begins with constructing a calibration curve to determine the concentration of reducing sugars using known glucose solutions and the DNS colorimetric method.

• Calibration of the spectrophotometer is essential, starting with a blank tube containing only water and DNS, which should yield an absorbance of zero.

Absorbance Measurements

• The absorbance readings from various tubes are recorded: Tube 2 at 0.107, Tube 3 at 0.263, Tube 4 at 10.580, Tube 5 at 1.129, Tube 6 at 1.300, and Tube 15 at 1.315.

• These absorbance values will be plotted against known glucose concentrations to create the calibration curve.

Plotting and Equation Derivation

• A graph correlating known glucose concentrations with their respective absorbances is created; this allows for extracting a trend line.

• The equation derived from the trend line is y = 0.68x - 0.0014, where x represents glucose concentration and y represents absorbance.

Hydrolysis Experiments

Experimental Setup

• Two different hydrolysis conditions are set up: one for acid hydrolysis (100°C) and another for enzymatic hydrolysis (37°C).

• Multiple test tubes will be used to detect starch and reducing sugars over various time intervals during these reactions.

Hydrolysis Process

• Each bath contains a test tube with a 1% starch solution acclimatizing to the desired temperature before initiating hydrolysis.

• For acid hydrolysis, concentrated hydrochloric acid (0.2 ml) is added; for enzymatic hydrolysis, saliva containing alpha-amylase diluted in imidazole buffer (pH 7.2).

Sampling Procedure

• Immediately after adding reagents, samples of each reaction are taken (0.2 ml each for glucose testing and DNS testing).

• This sampling marks "time zero," capturing initial conditions right after reagent addition.

Testing Procedures

Reaction Monitoring

• After mixing reagents in both setups, additional samples are collected every five minutes to monitor changes in sugar concentration.

Use of Indicators

• Lugol's solution is added as an indicator for starch presence; DNS solution neutralizes acidity while stopping enzyme activity.

Final Steps

Hidrólise Ácida e Enzimática: Coleta de Alíquotas

Procedimentos Iniciais

• A coleta das alíquotas para os testes de Hidrólise Ácida I e II começa, incluindo a preparação para o teste do Google e do DNS, com 0,2 ml de cada alíquota.

• As alíquotas são mantidas em temperatura controlada enquanto se adiciona DNS aos tubos correspondentes, utilizando 1 ml de DNS.

Coletas em Intervalos de Tempo

• Após 10 minutos, é feita uma nova coleta: 2 ml da Hidrólise Ácida para o teste do Google e 2 ml para o teste do DNS. O próximo intervalo será em 15 minutos.

• Ao atingir os 15 minutos, as alíquotas são coletadas novamente: 2 ml da Hidrólise Ácida e dos testes correspondentes.

• Completando um total de 20 minutos, as últimas alíquotas são coletadas para análise dos testes do Google e DNS.

Análise das Amostras

• O processo finaliza com a adição de três gotinhas do reagente Lugol e mais 1 ml de DNS nas amostras coletadas.

• A coleta abrange tanto a Hidrólise Ácida quanto a Enzimática, visando detectar amido (teste do Google) e açúcares redutores (teste do DNS).

Preparação para Testes Finais

• Os tubos precisam ser tratados antes da análise; água destilada é adicionada para facilitar a visualização dos resultados.

• Cada tubo recebe 10 ml de água destilada antes da homogenização para garantir uma coloração uniforme nos resultados.

Observações sobre Resultados

• A coloração dos tubos indica que conforme o tempo avança na Hidrólise, a intensidade da reação do Google diminui, sugerindo redução no amido presente.

• Na Hidrólise Enzimática também se observa uma mudança na coloração; inicialmente escura devido à presença de polissacarídeos que se tornam mais claros ao longo do tempo.

Reações Finais

• Para realizar o teste DNS adequadamente, todos os tubos recebem agora água destilada antes de serem aquecidos a 100 graus por cinco minutos.

• Durante este período, observa-se que a intensidade da reação do DNS aumenta conforme os açúcares redutores se concentram na solução.

Hidrólise Ácida e Enzimática do Amido

Resultados da Hidrólise Ácida

• A absorbância do tubo no tempo zero é de 0,430, enquanto após 5 minutos a absorbância aumenta para 0,836. Após 10 minutos, a absorbância atinge 1,004 e em 15 minutos chega a 1,040. Finalmente, aos 20 minutos, a absorbância é de 1,260.

Resultados da Hidrólise Enzimática

• No início (tempo zero), a reação do DNS apresenta uma absorbância de 0,613. Após cinco minutos, essa medida sobe para 1,100; aos dez minutos é de 1,290; e em quinze minutos atinge um valor ainda maior. Em vinte minutos a leitura final é de 1,406.

Interpretação dos Resultados

• As leituras indicam que tanto na hidrólise ácida quanto na enzimática há uma diminuição da quantidade de amido ao longo do tempo devido à degradação observada pela redução da cor na reação com lugol. Ao mesmo tempo, os açúcares redutores aumentam conforme o tempo avança.

Gráficos e Análise Comparativa

• Um gráfico genérico mostra que a intensidade da cor do lugol diminui enquanto a intensidade da cor na reação do DNS aumenta com o tempo de hidrólise. Isso indica que quanto mais prolongado o processo de hidrólise maior será a quantidade de açúcares redutores liberados na solução.

Estabilização das Reações

• Após um certo período (aproximadamente dez minutos), as reações se estabilizam: o lugol não consegue mais interagir com as moléculas de amido consumidas e sua intensidade mínima é alcançada; por outro lado, o DNS atinge seu máximo refletindo uma alta concentração de açúcares redutores disponíveis na solução resultante da hidrólise completa do amido.

Concentrações Finais dos Açúcares Redutores

• Os valores das absorbâncias obtidos nas reações podem ser convertidos em concentrações utilizando uma curva de calibração previamente estabelecida no primeiro experimento. Essa conversão permite traçar um gráfico relacionando o tempo da reação com as concentrações dos açúcares redutores produzidos durante os processos ácidos e enzimáticos ao longo dos tempos analisados (de zero até vinte minutos).

Comparação entre Hidrólises Ácida e Enzimática