Vídeo 2 NGS Luciana Montenegro

Introdução ao Sequenciamento de Nova Geração

Apresentação da Palestrante

• Luciana Montenegro, bióloga com doutorado e pós-doutorado em ciências pela USP, introduz o tema do sequenciamento paralelo em larga escala.

Desenvolvimento do NGS

• O sequenciamento de nova geração (NGS) começou a ser desenvolvido em 2005, visando acelerar resultados e reduzir custos em comparação às técnicas tradicionais.

• O custo do projeto Genoma Humano foi de 3 bilhões de dólares e levou mais de 10 anos para ser concluído; atualmente, o sequenciamento pode custar até $100.

Evolução das Técnicas de Sequenciamento

• As técnicas são divididas em três gerações:

• Primeira geração: sequenciamento Sanger.

• Segunda geração: tecnologias como Illumina e Ion Torrent.

• Terceira geração: sequenciamentos long reads com técnicas como PacBio.

Aplicações do Sequenciamento

Diversidade nas Aplicações

• O NGS é amplamente utilizado em diversas áreas, incluindo genômica, metagenômica e estudos de ancestralidade.

Preparação das Amostras

• A preparação das amostras envolve amplificação da biblioteca antes do sequenciamento. Foca-se no exoma que inclui todas as regiões codificadoras dos genes humanos.

Diferença entre Exoma e Painéis

Definições Importantes

• O exoma abrange todas as regiões codificadoras dos genes, enquanto os painéis permitem selecionar quais regiões estudar, podendo incluir regiões regulatórias.

Fluxo de Trabalho do Sequenciamento

Etapas do Processo

• O fluxo de trabalho é dividido em quatro etapas:

• Preparo das bibliotecas.

• Geração de clusters (PCR).

• Sequenciamento propriamente dito.

• Análise dos dados.

Preparação das Amostras para Sequenciamento

Avaliação da Qualidade do DNA

• A qualidade das amostras é avaliada através da integridade e dosagem usando gel de agarose e equipamentos como Nanodrop e Qubit para garantir que o DNA esteja adequado para análise.

Fragmentação Controlada

Preparação e Sequenciamento de DNA

Fragmentação e Reparo do DNA

• O processo começa com a fragmentação do DNA, que pode resultar em extremidades irregulares. É necessário um reparo das fitas para regularizar essas extremidades.

• Após o reparo, adiciona-se uma calda poli-A, essencial para a ligação de sequências adaptadoras, que são cruciais para o sequenciamento posterior.

Filtragem e Purificação

• Após cada etapa, realiza-se uma filtragem utilizando beads magnéticas (Bids), que se ligam ao DNA. A aplicação de magnetismo permite separar o DNA puro da sujeira presente na amostra.

• Uma eluição com água é feita após a filtragem para obter o DNA limpo e purificado.

Automação no Preparo do DNA

• Um robô pipetador automático é utilizado para agilizar o preparo do DNA, permitindo maior precisão e velocidade na manipulação das amostras.

• Essa automação possibilita trabalhar com um grande número de amostras simultaneamente, reduzindo erros de pipetagem.

Amplificação e Indexação

• Após adicionar os adaptadores, realiza-se uma amplificação das bibliotecas por meio de PCR comum. Em seguida, nova purificação é feita usando beads magnéticas.

• Para identificar as amostras durante o sequenciamento, utiliza-se sequências de índice comercialmente disponíveis que permitem agrupar as amostras em um único tubo.

Hibridização e Captura

• O próximo passo envolve hibridização com sondas específicas que reconhecem regiões-alvo do DNA. Essas sondas são marcadas com biotina.

• Após duas horas de incubação em uma máquina PCR, as sondas devem reconhecer suas regiões específicas no DNA alvo.

Purificação Final e Sequenciamento

• Uma nova purificação é realizada usando beads estreptavidina que se ligam à biotina nas sondas. Isso assegura que apenas o DNA marcado seja retido.

• Após a captura das amostras, outra amplificação por PCR é feita antes da quantificação final para preparar as amostras para sequenciamento.

Monitoramento do Sequenciamento

• Durante o sequenciamento, os dados são enviados para a nuvem (Base Space), permitindo monitorar o progresso remotamente.

• Uma planilha detalha quais pacientes correspondem a cada sequência de índice, facilitando a separação das amostras após o sequenciamento.

Geração de Clusters

• Antes do sequenciamento propriamente dito, ocorre uma amplificação chamada geração de clusters através da técnica conhecida como PCR em ponte.

Sequenciamento de DNA e Análise de Dados

Introdução ao Sequenciamento em Ponte

• O vídeo da Illumina apresenta sequências de adaptadores que são complementares às sequências adicionadas no início do preparo das amostras de DNA.

• A ligação do DNA à sequência adaptadora complementar permite a síntese de uma nova fita de DNA, liberando a sequência original durante o processo.

• O método conhecido como "sequenciamento em ponte" envolve amplificação por PCR, onde as amostras são clusterizadas dentro do aparelho sequenciador.

Processo de Sequenciamento

• O sequenciamento NGS (Next Generation Sequencing) é realizado por síntese, onde cada nucleotídeo incorporado libera fluorescência, capturada pelo sistema ótico do aparelho.

• Durante o sequenciamento, uma imagem é gerada que se assemelha a uma constelação devido à quantidade de fluorescências produzidas.

• O processo inclui duas corridas: "read one" para a primeira leitura e "read two" para a leitura reversa, com nova clusterização e amplificação.

Análises dos Dados Gerados

• As análises informáticas incluem três etapas principais: análise primária (dados brutos), alinhamento e montagem das sequências chamadas "reads".

• Utilizando pipelines específicos, as sequências são separadas por paciente e comparadas com uma sequência referência do genoma.

• Os arquivos gerados permitem trabalhar com variantes identificadas e avaliar a qualidade do alinhamento.

Análise Terciária e Filtragem

• A análise terciária não requer profundo conhecimento em bioinformática; ferramentas modernas facilitam essa tarefa.

• Variantes diferentes da sequência referência são priorizadas como candidatas potenciais para doenças ou fenótipo específico.

• Softwares como Franklin ajudam na priorização das variantes relacionadas ao fenótipo descrito pelo pesquisador.

Aplicações Clínicas e Resultados

• Laboratórios oferecem painéis gênicos e exomas comercialmente disponíveis para diversas condições, incluindo câncer e endocrinopatias.

• Estudos recentes demonstraram resultados positivos no uso de NGS em endocrinopatias, destacando pesquisas sobre puberdade precoce lideradas pela professora Ana Cláudia Latrônico.

Importância da Representatividade na Análise de Variantes

Análises de Prioridade e Dados Populacionais

• As análises de priorização de variantes são frequentemente comparadas com dados populacionais, que geralmente têm uma maioria europeia.

• A população brasileira é muito diversificada e "mixada", o que torna essencial a representatividade dos dados utilizados nas análises.

• O uso de dados representativos da população brasileira é crucial para obter resultados mais precisos e relevantes nas pesquisas.

• Atualmente, a abordagem adotada tem utilizado muitos dados disponíveis para garantir essa representatividade.