Seminario 1 Introducción a la metodología científica BCM- Gabriel Scicolone

Comprendiendo la Organización de la Materia

Introducción a la Charla

• La charla se centra en entender que la materia está organizada en distintos niveles, cada uno estudiado por diferentes ciencias con metodologías específicas.

• Se busca que los participantes reconozcan cómo los científicos generan conocimiento a través de experimentos y generalizan resultados.

Metodologías Científicas

• Los científicos en biología celular y molecular utilizan un enfoque inductivo para generar conocimiento mediante experimentos.

• El equipo de salud, incluyendo médicos, aplica estos conocimientos utilizando un método deductivo para resolver problemas específicos de pacientes.

Objetivos de Aprendizaje

• Comprender que el conocimiento científico proviene de trabajos donde se aplican técnicas para responder preguntas e hipótesis planteadas.

• Reconocer el uso de modelos experimentales en investigaciones científicas y su aplicación práctica en medicina asistencial.

Niveles de Organización de la Materia

• La materia presenta varios niveles: atómico, molecular, celular, tejido, órgano y organismo; cada uno con su complejidad específica.

• Los tejidos forman órganos que se organizan en sistemas o aparatos; esto permite estudiar desde organismos unicelulares hasta pluricelulares como los humanos.

Instrumentos y Resolución Óptica

• Diferentes ciencias utilizan instrumentos ópticos para obtener información sobre los niveles de organización; el límite del ojo humano es 100 micrones.

Microscopios y su Aplicación en Ciencias Biológicas

Poder de Resolución de los Microscopios

• Los microscopios electrónicos tienen un poder de resolución superior al del ojo humano, permitiendo diferenciar puntos separados por hasta 0,2 nanómetros.

• En comparación, el ojo humano puede distinguir detalles a una distancia mínima de 100 micrones, mientras que el microscopio óptico llega hasta 0,2 micrones.

Importancia de la Anatomía y la Histología

• La anatomía estudia la organización del cuerpo humano utilizando el poder resolutivo del ojo para analizar sistemas y órganos.

• La histología se centra en el estudio de tejidos mediante microscopía óptica, permitiendo observar la organización celular y la matriz extracelular.

Avances en Biología Celular

• La microscopía electrónica marcó el inicio de la biología celular, facilitando el estudio detallado de las células y sus componentes.

• Las técnicas bioquímicas y moleculares han permitido investigar a nivel macromolecular y molecular las funciones celulares.

Diferencias entre Ciencias Biológicas

• La anatomía utiliza observaciones visuales; la histología emplea microscopía óptica; mientras que la biología celular usa microscopía electrónica para estudiar células y matrices extracelulares.

• La biología molecular aplica técnicas específicas para localizar componentes químicos dentro de células y tejidos.

Técnicas Histológicas Comunes

• Se utilizan coloraciones como hematoxilina y eosina para identificar estructuras tisulares.

• El tricrómico de Mallory ayuda a visualizar componentes como fibras colágenas en los tejidos.

Ejemplos Visuales en Microscopía

• Se presentan imágenes obtenidas con diferentes técnicas: cortes coloreados con métodos estándar o contrastes especiales que permiten ver cromosomas durante divisiones celulares.

• Comparaciones entre microscopías óptica (con coloración vital) y electrónica muestran estructuras celulares como mitocondrias o filamentos de actina.

Métodos Científicos en Biología

• Los científicos aplican un método inductivo para generalizar conocimientos; los médicos usan un enfoque deductivo para resolver problemas específicos.

¿Cómo se genera y valida el conocimiento científico?

Generalización de resultados estadísticos

• Los resultados estadísticos permiten generalizar hallazgos a toda una población, dado que muchos mecanismos celulares y moleculares son conservados a lo largo de la evolución.

• El conocimiento obtenido en un modelo animal puede ser transferido a la especie humana, lo que resalta la importancia de los estudios comparativos.

Publicación y revisión científica

• La producción de conocimiento científico se realiza mediante trabajos publicados en revistas científicas, donde los científicos envían sus investigaciones para su evaluación.

• Un editor o un grupo de editores evalúa si el trabajo es adecuado para la temática de la revista antes de enviarlo a revisores pares, quienes son expertos en el tema del estudio.

Proceso de evaluación por pares

• Los revisores analizan la metodología y redacción del trabajo; si es adecuado, informan al editor sobre su idoneidad para publicación.

• Si el trabajo no cumple con los estándares requeridos, puede ser rechazado o se pueden solicitar modificaciones para mejorar su calidad.

Importancia del método científico

• El trabajo científico es fundamental porque se basa en una metodología reproducible y crítica. Debe incluir información suficiente para permitir que otros investigadores reproduzcan los resultados.

• Se utiliza un método inductivo en las ciencias biológicas que permite generalizar conocimientos basados en observaciones específicas.

Estructura de un trabajo científico

• Un trabajo científico incluye: título (que resume el descubrimiento), autores con sus filiaciones, resumen (abstract), palabras clave (keywords), introducción, materiales y métodos, resultados, discusión y bibliografía.

• En la introducción se plantea el contexto del estudio y los objetivos; mientras que en materiales y métodos se describe cómo se abordaron las preguntas planteadas.

Resultados y discusión

• La sección de resultados presenta hallazgos acompañados por figuras ilustrativas. La discusión interpreta estos hallazgos en relación con otros estudios previos.

Tipos de trabajos científicos y su acceso

Tipos de trabajos en investigación

• Se mencionan diferentes tipos de trabajos científicos, como estudios clínicos que evalúan la utilidad de sistemas diagnósticos y terapéuticas.

• Los ensayos clínicos son pruebas específicas para medicaciones, mientras que las descripciones de casos abordan patologías raras con menor nivel de conocimiento.

Acceso a trabajos científicos

• Existen buscadores bibliográficos como Pavmed y Cielo Lilax que permiten acceder a trabajos científicos en línea.

• Para buscar información específica, se utilizan palabras clave relacionadas con el tema de interés, como "cáncer de mama" o "mutaciones p53".

Accesibilidad y tipos de publicaciones

• Los trabajos pueden ser de acceso libre o requerir suscripción; los primeros son financiados por investigadores tras la aceptación del trabajo.

• Las revistas con acceso restringido limitan el acceso al lector, aunque no requieren pago por parte del investigador.

Importancia de las revisiones y bibliografía

Revisiones científicas

• Las revisiones son análisis realizados por expertos sobre investigaciones recientes en un área específica.

• La bibliografía al final de los capítulos en libros serios respalda la información presentada, mostrando la conexión entre libros y trabajos científicos.

Contribución al conocimiento

• Los trabajos científicos aportan nuevo conocimiento fundamental para el avance científico; los libros deben basarse en estos para ser considerados válidos.

Metodología científica y modelos experimentales

Experimentación en biología celular

• En biología celular se realizan experimentos utilizando un número reducido de animales para generalizar conocimientos a toda una especie.

Conservación evolutiva

• Se ha demostrado que ciertos mecanismos celulares se conservan a través de la evolución, lo cual justifica el uso de modelos experimentales tanto unicelulares como pluricelulares.

Mecanismos Moleculares en la Evolución

Conservación de Procesos Moleculares

• La síntesis proteica y la transcripción son procesos moleculares muy conservados a lo largo de la evolución, similares en todos los organismos eucariontes.

• Los experimentos realizados con organismos unicelulares eucariontes pueden transferirse a otras especies eucariontes debido a la conservación de estos mecanismos desde el origen de la vida.

• La investigación inicial sobre síntesis proteica se realizó en procariontes, que son modelos más simples, antes de ser estudiados en eucariontes, mostrando una base común con diferencias complejas.

Aplicaciones Prácticas en Investigación

• Los conocimientos adquiridos mediante estudios experimentales pueden aplicarse a humanos; por ejemplo, las pruebas clínicas para medicamentos se realizan tras su validación en animales.

• Se utilizan cultivos bacterianos como modelos experimentales para estudiar mecanismos moleculares básicos debido a su simplicidad y unicelularidad.

Modelos Experimentales y Complejidad

Organismos Unicelulares

• Las levaduras son ejemplos de organismos unicelulares donde se han realizado estudios sobre manipulación genética y regulación del ciclo celular.

Invertebrados y Pluricelulares Sencillos

• El gusano C. elegans es un invertebrado pluricelular sencillo que permite estudios genéticos sobre el destino celular debido a su número específico de células genéticamente establecidas.

Drosófila Melanogaster

• En la mosca de la fruta se han realizado importantes investigaciones sobre genes homeóticos que determinan características celulares específicas durante el desarrollo embrionario.

Avances hacia Vertebrados

Zebrafish y Ratones como Modelos Experimentales

• El pez zebrafish es útil para estudiar desplazamientos celulares durante el desarrollo gracias a su transparencia, permitiendo transferir hallazgos al ser humano.

• Los ratones son ampliamente utilizados en experimentación por ser mamíferos que comparten similitudes con los humanos; se reproducen rápidamente y permiten evaluar fenotipos como el vitiligo.

Conclusiones sobre Modelos Experimentales

• Los modelos experimentales demuestran similitudes entre procesos celulares y moleculares en diferentes especies, lo cual es fundamental para entender enfermedades humanas.

Comparación de Efectos en Procesos Experimentales

Comparación entre Grupos Control y Tratados

• Se puede comparar la respuesta en un proceso específico entre un grupo control (no tratado) y un grupo tratado con una droga, observando las diferencias en los resultados.

Estudios In Vivo vs. In Vitro

• Los estudios realizados en animales se denominan estudios in vivo, donde se pueden controlar variables fisiológicas, pero también hay muchas variables que pueden influir en los resultados.

Aislamiento Celular para Controlar Variables

• Para reducir las variables que afectan el comportamiento celular, se pueden aislar células del organismo y realizar cultivos celulares, permitiendo tratar esas células con la droga sin interferencias externas.

Ventajas y Desventajas de Estudios In Vitro

• Los estudios in vitro permiten un mejor aislamiento de variables, aunque se alejan del estado fisiológico real. Esto es crucial al estudiar mecanismos moleculares como la respiración celular.

Fraccionamiento Subcelular

• El fraccionamiento subcelular permite trabajar con diferentes partes de la célula para separar mejor las variables; sin embargo, esto también implica alejarse más de la fisiología normal.

Modelos Animales en Investigación

Ejemplos de Estudios In Vivo

• Se presentan ejemplos como ratas sometidas a pruebas conductuales y operaciones para estudiar efectos del alcoholismo materno sobre fetos.

Ratones Transgénicos

• Los ratones transgénicos tienen modificaciones genéticas que se transmiten a su descendencia. Un ejemplo incluye ratones con un gen que codifica una proteína fluorescente verde visible en sus ojos.

Técnicas Histológicas y Microscopía

Preparación de Muestras para Microscopía

• Para observar tejidos al microscopio óptico, es necesario fijar las muestras para conservar su estructura antes de cortarlas en segmentos pequeños.

Coloración de Tejidos

• La coloración es esencial para distinguir componentes dentro del tejido observado bajo el microscopio óptico; esto ayuda a visualizar diferencias entre distintos elementos celulares.

Diferentes Tipos de Microscopía

Métodos de Observación en Biología Celular

Microscopía y Cultivos Celulares

• La microscopía óptica permite observar moléculas específicas con alta resolución, siendo útil para estudios de biología celular y molecular. Se presentan ejemplos de estudios in vivo donde se observan cortes de tejidos.

• Para obtener células, se corta un tejido en fragmentos, se trata con enzimas que rompen las uniones intercelulares y se centrifuga para formar un precipitado celular.

• Las células obtenidas se colocan en cápsulas de Petri dentro de incubadoras a 37°C con alta concentración de CO2, manteniendo la esterilidad para evitar contaminación.

• Los cultivos celulares se desarrollan en estufas e incubadoras; una vez que proliferan, pueden disgregarse para realizar cultivos secundarios y experimentos adicionales.

• Algunas células genéticamente modificadas pueden proliferar indefinidamente y ser congeladas en nitrógeno líquido a -160°C para su conservación a largo plazo.

Técnicas Avanzadas de Observación

• Se utiliza un microscopio invertido que permite observar las células desde la parte inferior de la cápsula de Petri. Esto es diferente al microscopio convencional utilizado en histología.

• Con técnicas como el contraste de interferencia diferencial, es posible observar cultivos celulares sin teñirlas, reconociendo sus formas y estructuras.

• En algunos casos, se emplea un microscopio invertido de epifluorescencia que emite radiaciones que activan fluorocromos introducidos en las células, permitiendo visualizar componentes específicos como el núcleo o mitocondrias.

• La fluorescencia verde indica la presencia de ADN modificado que codifica proteínas fluorescentes inocuas; además, los colorantes vitales permiten marcar mitocondrias sin dañar las células.

• Se comparan grupos tratados con drogas frente a controles no tratados para evaluar efectos experimentales sobre los cultivos celulares observados bajo condiciones controladas.

Fraccionamiento Subcelular

• El fraccionamiento subcelular busca obtener fracciones puras o enriquecidas de componentes celulares mediante métodos mecánicos y químicos específicos.

• Este proceso incluye la ruptura mecánica del tejido (ejemplo: hígado), seguido por la trituración y tratamiento con detergentes para facilitar la disgregación celular.

Métodos de separación celular

Proceso de centrifugación

• La ruptura del tejido permite disolver todos los componentes en un homogéneo, que luego se separan mediante centrifugación.

• La centrifugación aplica fuerzas gravitatorias superiores a la normal, haciendo que los componentes más densos se depositen en el fondo y los menos densos queden flotando.

• Se somete el homogéneo a 1000 g durante 10 minutos para obtener un pelet de células enteras y núcleos, dejando un sobrenadante.

Separación de organelas

• El sobrenadante se centrifuga nuevamente a 20,000 g durante 20 minutos, obteniendo un pelet con mitocondrias, lisosomas y peroxisomas.

• Se realiza una ultracentrifugación adicional a 80,000 g por una hora para aislar microsomas del retículo endoplasmático.

Confirmación de fracciones celulares

• Un nuevo proceso de ultracentrifugación a 100,000 g durante tres horas produce un pelet con ribosomas y macromoléculas grandes.

• Para verificar la pureza de las fracciones celulares, se evalúa la actividad enzimática específica; por ejemplo, usando citocromo oxidasa para confirmar la presencia de mitocondrias.

Métodos adicionales de verificación

• Si el producto coloreado aparece tras añadir sustrato a la fracción mitocondrial, indica su enriquecimiento; si no hay color o es escaso, sugiere baja cantidad de mitocondrias.

• Se pueden usar diferentes enzimas específicas para evaluar otras fracciones como microsomas o citosol.

Observaciones microscópicas

• La observación al microscopio electrónico permite identificar morfologías específicas: fracciones nucleares, mitocondriales y microsomales.

• Esto confirma que las fracciones han sido purificadas correctamente para estudios posteriores sobre reacciones bioquímicas.

Centrifugación con gradientes de densidad

Separación basada en densidad

• Utilizando gradientes de densidad (ej. sacarosa), los componentes se separan según su densidad; los microsomas quedan más abajo que ribosomas sueltos.

Aplicaciones experimentales

• Este método permite separar sinapsis en tejidos nerviosos y estudiar interacciones químicas entre componentes celulares.

Modelos experimentales en biología

Importancia del modelo experimental

Metodología Científica y Obtención de Muestras

Rol del Médico en el Diagnóstico

• El médico utiliza estudios complementarios para diagnosticar patologías y predecir la evolución del paciente, lo que ayuda a definir tratamientos adecuados.

Tipos de Muestras

• La muestra más común es la sangre, obtenida con jeringa y aguja. Se puede permitir que precipite para separar glóbulos y plasma.

• También se pueden obtener muestras de médula ósea si hay problemas relacionados con los elementos formados en la sangre.

Métodos de Obtención de Muestras

• La médula ósea se puede punzar para obtener células o tejido, permitiendo observar su organización al microscopio.

• En casos como acidez estomacal, se puede realizar una endoscopía para obtener biopsias de lesiones y estudiarlas microscópicamente.

Técnicas Histológicas

• Se presentan distintas técnicas para obtener muestras tanto en modelos experimentales como en pacientes. Esto incluye la obtención de plasma o tejido mediante biopsia.

• Las muestras deben fijarse adecuadamente para conservar su estructura antes de ser observadas al microscopio, ya sea células sanguíneas o porciones de tejido.

Análisis Bioquímico

• Las muestras también pueden ser utilizadas para estudios bioquímicos sin importar su localización; por ejemplo, se puede homogeneizar un tejido para estudiar proteínas o enzimas específicas.

• Existen técnicas histológicas y citológicas que permiten discernir componentes celulares como núcleo y citoplasma mediante coloraciones habituales.

Localización de Proteínas

• Se pueden utilizar técnicas como inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para localizar proteínas dentro del tejido obtenido, aplicable a muestras humanas o animales.

Métodos de Purificación y Análisis de Moléculas Biológicas

Obtención y Fraccionamiento de Muestras

• Se pueden obtener muestras biológicas que conservan su estructura (tejidos, proteínas, ácidos nucleicos) o material no estructurado (plasma, homogenizados).

• A partir del homogenizado se puede purificar ADN, ARN o proteínas para realizar estudios funcionales como análisis enzimáticos.

Técnicas de Electroforesis y Análisis Molecular

• La electroforesis permite separar moléculas por carga eléctrica y tamaño; se utilizan técnicas como Southern Blot para ADN, Northern Blot para ARN y Western Blot para proteínas.

• Se puede amplificar ADN mediante PCR y producir ADN complementario a partir de ARN usando transcriptasa reversa.

Manipulación Genética

• Los ácidos nucleicos purificados pueden ser manipulados para crear moléculas recombinantes e introducirlas en modelos experimentales.

• La técnica CRISPR permite producir mutaciones en el ADN para evaluar sus consecuencias en células o individuos.

Flujo de Información Genética

• El flujo de información genética va desde el ADN hasta las proteínas; existen diversas técnicas que permiten analizar cada nivel de expresión génica.

• Las técnicas incluyen amplificación del ADN (PCR), hibridación y edición genética, permitiendo un análisis detallado del material genético.

Análisis Avanzado del Genoma

• Existen metodologías que analizan porciones específicas del ADN así como todo el genoma mediante hibridación en micromatrices y secuenciación masiva.

• Las técnicas permiten reconocer distintas partes del genoma completo, facilitando la investigación genética integral.

Estudio de ARN y Proteínas

• Para los ARN se utilizan técnicas individuales como RT-qPCR e hibridación in situ; el análisis del transcriptoma evalúa todos los ARN presentes en una célula o tejido.

¿Cómo se analizan y manipulan las moléculas biológicas?

Técnicas de separación y análisis

• La electroforesis y la cromatografía son técnicas que permiten separar proteínas de un tejido. Posteriormente, estas proteínas pueden ser analizadas mediante espectrometría de masas, lo que proporciona información sobre todas las proteínas presentes en una célula o tejido.

• Existen diversas técnicas para analizar y manipular ADN, ARN y proteínas. A la izquierda del esquema se encuentran las técnicas que trabajan a nivel de una sola molécula, mientras que a la derecha están aquellas que ofrecen información sobre el conjunto de moléculas en una célula o tejido.

Resumen de contenidos abordados

• En la clase se discutieron los niveles de organización de la materia y cómo diferentes ciencias utilizan distintos instrumentos para estudiar estos niveles. Se enfatizó la importancia del enfoque multidisciplinario en el estudio biológico.

• Se abordó la metodología científica, incluyendo el método inductivo y los trabajos científicos. También se mencionaron modelos experimentales y estudios in vivo, in vitro y libres de células como enfoques clave en investigación.