Seminario 5 Regulación de la expresión génica II - Sebastian Giusti

Análisis de la Regulación de la Expresión Génica

Introducción a la Clase

• La clase se centra en los niveles postranscripcional, traduccional y posttraduccional de la regulación de la expresión génica.

• Se busca comprender cómo esta clase complementa el contenido anterior sobre regulación pretranscripcional.

Recapitulación de Clases Anteriores

• En la clase anterior, se abordaron los pasos iniciales de la expresión génica, destacando el papel de la condensación de cromatina.

• Se discutieron mecanismos que regulan el inicio y frecuencia de transcripción mediante factores específicos que interactúan con el ADN.

Mecanismos Moleculares

• Los factores específicos pueden reclutar modificadores epigenéticos como complejos modificadores de histonas y remodeladores de cromatina.

• Dependiendo del tipo de elemento (potenciador o silenciador), estos factores afectan positivamente o negativamente el inicio de transcripción.

Transición a Nuevos Temas

• La clase actual se enfocará en aspectos posteriores al inicio de transcripción, incluyendo procesamiento y estabilidad del ARN mensajero (ARNm).

• Se analizarán también mecanismos que regulan tanto la estabilidad como actividad proteica.

Propiedades del ARN

• A diferencia del ADN, las moléculas de ARN son lábiles y se degradan fácilmente bajo condiciones adversas como cambios en pH o temperatura.

• Dentro celularmente, las nucleasas específicas degradan ARN mediante exonucleasas y endonucleasas, lo que resalta su vulnerabilidad.

Estructura Tridimensional del ARN

• Aunque comúnmente representadas linealmente, las moléculas de ARN adoptan conformaciones tridimensionales complejas dentro celularmente.

Procesamiento del ARN Mensajero en Eucariotas

Introducción al Procesamiento del ARN

• El procesamiento del ARN mensajero (ARNm) implica modificaciones que sufre el transcripto primario hasta convertirse en un ARNm maduro, listo para ser exportado al citosol.

• Este proceso incluye tres pasos moleculares: modificación del extremo 5' (capping), corte y empalme de exones (splicing), y modificación covalente del extremo 3'.

Pasos Moleculares en el Procesamiento

• Los pasos de procesamiento no son secuenciales; ocurren simultáneamente mientras la ARN polimerasa II transcribe el transcripto primario.

• Las enzimas y proteínas responsables de cada paso están asociadas a la ARN polimerasa, facilitando la coordinación entre transcripción y procesamiento.

Modificación del Extremo 5'

• La modificación conocida como capping es una unión covalente de un nucleótido modificado al extremo 5', protegiendo este extremo de la degradación por exonucleasas.

• El nucleótido añadido es una guanosina metilada, que permite el reconocimiento por complejos proteicos denominados CBC (Cap Binding Complex).

Modificación del Extremo 3'

• En el extremo 3', se añade una cola de poliadenina tras un corte catalizado por enzimas específicas, lo cual no está codificado en el genoma.

• Esta cola también protege contra exonucleasas y facilita la exportación y reconocimiento por maquinaria traductora.

Corte y Empalme de Exones

¿Cómo se procesan los intrones y exones en el ARN?

Estructura de los genes eucariotas

• Los genes eucariotas son discontinuos, lo que significa que las secuencias presentes en el transcripto maduro no están dispuestas de manera continua en el genoma. Estas secuencias están fragmentadas y dispersas por otras secuencias de ADN.

• Las secuencias del ADN que se representan en el transcripto maduro se denominan exones, mientras que las secuencias intermedias que serán removidas durante el procesamiento se llaman intrones.

• Generalmente, los exones son más pequeños que los intrones, representando una proporción minoritaria del total de la secuencia de ADN.

Proceso de remoción de intrones

• La remoción de intrones es un proceso molecular preciso que implica el corte de enlaces covalentes y la unión posterior de exones separados por un intrón.

• Un error molecular en este proceso podría alterar cómo se leen los codones durante la traducción, afectando negativamente a la célula.

Mecanismos moleculares involucrados

• Durante las décadas de 1970 y 1980, la comunidad científica investigó cómo se removían los intrones con precisión. Se identificaron secuencias llamadas "secuencias consenso del splicing" que guían a la maquinaria molecular responsable.

• Estas secuencias consenso están ubicadas en tres áreas: el sitio dador del splicing (extremo 5'), el sitio aceptor del splicing (extremo 3') y un sitio de ramificación dentro del exón.

El espliciosoma

• El espliciosoma es un complejo molecular compuesto por ribonucleoproteínas y ARNs pequeños nucleares (snRNA), capaz de realizar cortes precisos durante el splicing.

• Este complejo está formado por cinco ribonucleoproteínas asociadas a snRNA, conocidas como snRNP o "snurps".

Reacciones durante el splicing

• Cada evento de splicing involucra dos reacciones secuenciales: corte y formación de nuevos enlaces covalentes, conocidas como transesterificaciones.

• La primera reacción genera un pequeño lazo en el punto de ramificación al formar un enlace covalente entre nucleótidos específicos; luego, una segunda reacción une los extremos libres restantes tras remover el intrón.

Catalizadores biológicos

Mecanismos del Splicing Alternativo en Eucariotas

Complejo de Unión a Exones

• Se menciona un residuo proteico en el sitio donde se produjo el empalme (splicing) de hexones, que antes estaban separados por un intrón. Este sitio está representado en un esquema con un cuadrado rojo denominado complejo de unión a exones.

Variabilidad del Splicing en Diferentes Tejidos

• El splicing ocurre durante la transcripción de cualquier ARN eucariota, pero no es uniforme; varía según el tejido y el momento del desarrollo.

• Un exón puede comportarse como tal en ciertos tejidos, contribuyendo a la codificación de aminoácidos, mientras que en otros tejidos puede ser tratado como un intrón y ser removido.

Isoformas Proteicas

• Distintos tejidos pueden generar isoformas de una misma proteína a partir del mismo gen. Por ejemplo, el gen de la tropomiosina se expresa tanto en músculo estriado como en otros tejidos.

• Al comparar las secuencias que actúan como exones entre diferentes tejidos (músculo estriado vs cerebro), se observan diferencias significativas.

Regulación del Splicing Alternativo

• El splicing alternativo aumenta la capacidad codificante del genoma al permitir que diferentes transcriptos primarios generen variantes funcionales de una misma proteína.

• Algunas secuencias pueden actuar como exones o intrones dependiendo del contexto tisular o temporal.

Mecanismos Moleculares y Secuencias Consenso

• La alteración más común observada es el "salteo" de exones, donde ciertas secuencias actúan como exones en algunos tejidos y como intrones en otros.

• Las secuencias consenso son similares pero no idénticas entre los límites de exones e intrones; algunas tienen mayor afinidad para reclutar al spliciosoma.

Proteínas Reguladoras del Splicing

• Existen proteínas reguladoras que afectan cómo se lleva a cabo el splicing. En presencia de estas proteínas, un intrón puede no ser removido si bloquea su reconocimiento por parte del spliciosoma.

Splicing y Regulación del ARN Mensajero

Proceso de Splicing Alternativo

• El splicing alternativo depende de la presencia o ausencia de proteínas adicionales en tejidos específicos, lo que determina si un intrón será removido o permanecerá como un exón en el transcripto maduro.

• La variabilidad en el repertorio de proteínas reguladoras del splicing entre diferentes tipos celulares y momentos del desarrollo es la causa principal del splicing alternativo.

Estructura del ARN Mensajero Maduro

• Tras el procesamiento, el extremo 5' del ARN mensajero maduro contiene una caperuza (CAP), seguida por una región no traducida (5' UTR) antes del inicio de la traducción.

• La secuencia codificante comienza con el codón AUG, que inicia la traducción, seguido por una región no traducida al final (3' UTR), que precede a la cola poli-A.

Función de las Regiones No Traducidas

• Las regiones 5' UTR y 3' UTR son cruciales para regular la estabilidad del transcripto primario, aunque su representación idealizada no refleja completamente lo que ocurre dentro de las células.

Interacción con Proteínas y Exportación

• Los ARN mensajeros se asocian con diversas proteínas durante su maduración, incluyendo complejos de unión al CAP y a la cola poli-A, necesarios para su correcta exportación desde el núcleo hacia el citosol.

• Estas proteínas también facilitan interacciones con factores eucariotas de iniciación de la traducción, esenciales para comenzar este proceso.

Control de Calidad en Traducción

• La configuración circular formada por las interacciones entre proteínas permite un control de calidad molecular sobre los productos génicos, evitando que ARNs truncados sean exportados o traducidos incorrectamente.

• En condiciones óptimas, múltiples ribosomas pueden traducir simultáneamente un ARN mensajero maduro correctamente exportado, generando proteínas cada vez más largas a medida que avanzan en el proceso.

Degradación Mediadas por Codones Stop Prematuros

• Cuando se presenta un codón stop prematuro debido a mutaciones, estos ARNs son degradados para evitar la producción de proteínas truncadas.

Regulación de la estabilidad del ARN mensajero

Complejos de unión a exones y su impacto en la traducción

• Los complejos de unión a exones son cruciales para mantener la estabilidad del transcripto. Si un ribosoma encuentra un codón stop temprano, se despega y no afecta los complejos posteriores.

• La presencia de codones stop tempranos puede inducir la degradación prematura del transcripto, lo que impide que la célula produzca proteínas funcionales.

Mecanismos moleculares que regulan la estabilidad del ARN

• No todos los ARN mensajeros tienen la misma duración; algunos se degradan rápidamente mientras que otros son más estables, con vidas medias que pueden variar desde minutos hasta períodos prolongados.

• Los ARNs mensajeros inestables suelen ser aquellos relacionados con el ciclo celular, mientras que las proteínas estructurales tienden a tener vidas medias más largas.

Regulación diferencial de la degradación del ARN

• Existen mecanismos celulares que protegen ciertos ARNs mensajeros de las exonucleasas, permitiendo una regulación diferencial en sus vidas medias.

• Las proteínas de unión al ARN (RBPs) pueden influir en la estabilidad del transcripto dependiendo de su conformación tridimensional.

MicroARN y su papel en la regulación post-transcripcional

• Los microARN son pequeños ARNs no codificantes que regulan post-transcripcionalmente la expresión génica al unirse a un complejo proteico llamado RISC.

• Estos microARN guían el complejo RISC hacia segmentos específicos del ARN mensajero, lo cual puede llevar a reprimir su traducción o inducir su degradación.

Interferencia de ARN y aplicaciones terapéuticas

• El descubrimiento del fenómeno de interferencia de ARN ha permitido diseñar ARNs pequeños artificiales como fármacos para regular negativamente transcriptos problemáticos en ciertas condiciones.

• A diferencia de los controles pretranscripcionales, los microARN actúan como ecualizadores finos en los niveles de expresión génica, ajustando sutilmente estos niveles según sea necesario.

Actividad y regulación post-traduccional de las proteínas

• Una vez producidas las proteínas tras la traducción, muchas requieren modificaciones covalentes o interacciones específicas para activar su función biológica.

Regulación del Ciclo Celular y Mecanismos de Expresión Génica

Regulación Postraduccional

• La regulación del ciclo celular se activa mediante la fosforilación, donde las quinasas específicas actúan en los orígenes de replicación.

• Las modificaciones funcionales postraduccionales tienen efectos a corto plazo, ejecutándose en segundos o minutos, contrastando con cambios más lentos que requieren horas.

Ubiquitina y Degradación Proteica

• La vida media de las proteínas es regulada por el sistema ubiquitina-proteasoma, donde la ubiquitina se une a sustratos proteicos para su degradación.

• La poliubiquitinación implica una reacción mediada por tres tipos de enzimas: E1 (activadora), E2 (conjugadora) y E3 (reconocedora de sustratos).

• Las ligasas E3 son cruciales para la especificidad en la poliubiquitinación, activándose bajo condiciones celulares particulares.

Consecuencias de la Poliubiquitinación

• La adición de cadenas de poliubiquitinas a una proteína resulta en su degradación por un complejo proteico específico que actúa como proteasa.

• Un ejemplo común es la degradación de ciclinas, que regulan las quinasas dependientes de ciclinas durante el ciclo celular.

Reflexiones sobre Regulación Génica

• Se discuten diferentes mecanismos que regulan la expresión génica: desde el nivel cuantitativo hasta el cualitativo del producto génico.