Capitulo III Clasificacion de metodos - centrifugacion (video 2)

Clasificación de Métodos para la Separación de Biomoléculas

Introducción a los Métodos de Separación

• En este vídeo se estudia la clasificación de métodos para la separación de biomoléculas, agrupándolos según propiedades físico-químicas diferenciales.

• La separación puede realizarse aprovechando diferencias en solubilidad, tamaño, carga, volatilidad, reactividad química y afinidad.

Técnicas Comunes en Bioquímica

• La centrifugación es una técnica clave que permite separar fases de solventes y sedimentos insolubles mediante centrifugación diferencial o gradiente de densidad.

• Es crucial relacionar el método experimental con el sistema de ensayo final; un ensayo específico puede requerir menor purificación que uno menos específico.

Métodos Basados en Polaridad

• Se discuten métodos que utilizan diferencias en polaridad para separar compuestos; los disolventes son fundamentales en estos procedimientos.

• Las diferencias de solubilidad entre compuestos y contaminantes permiten concentrar ciertos componentes durante la purificación.

Ejemplos Prácticos

• Un ejemplo es la separación de ácidos grasos libres utilizando extracción con bicarbonato al 1% para facilitar su extracción sin ionización del grupo ácido.

• Los compuestos hidrofílicos permanecen en solución acuosa mientras que los ácidos grasos libres se extraen a un solvente orgánico.

Estrategias Avanzadas

• La remoción selectiva se logra alterando la composición del medio mediante cambios en pH, fuerza iónica o temperatura.

• La cromatografía es otra técnica donde las moléculas se distribuyen entre fase móvil y estacionaria según su similitud.

Precipitación Selectiva

• La precipitación selectiva utiliza sales como sulfato de amonio para separar fracciones proteicas sin desnaturalizarlas.

• Este proceso explota las características hidrofóbicas aumentando interacciones entre proteínas y formando agregados que precipitan.

Absorción y Reactividad Química

• Otro método basado en polaridad es la absorción, donde las moléculas son absorbidas por una fase sólida dependiendo de su polaridad.

Métodos de Separación en Química

Uso de la Reactividad Química Diferencial

• A pesar de ejemplos importantes, el uso de la reactividad química diferencial es limitado a ciertas aplicaciones. Solo un número reducido de moléculas es lo suficientemente inerte para resistir los reactivos necesarios para eliminar otros compuestos.

Métodos Basados en la Estabilidad y Desnaturalización

• Un método común es la destrucción de materia orgánica mediante combustión, dejando fósforo inorgánico como residuo, que se identifica posteriormente con métodos colorimétricos.

• La desnaturalización selectiva involucra condiciones específicas como temperatura y pH, permitiendo que las proteínas se desnaturalicen sin perder su actividad en algunos casos.

Saponificación y Separación de Lípidos

• La saponificación separa lípidos en fracciones saponificables e insaponificables mediante tratamiento con hidróxido de potasio, liberando ácidos grasos.

• Los lípidos insaponificables pueden ser separados usando éter de petróleo, mientras que los ácidos grasos libres quedan en solución acuosa alcalina debido a su polaridad.

Técnicas Basadas en Tamaño: Centrifugación y Filtración

• La centrifugación y filtración son técnicas alternativas para separación; por ejemplo, un precipitado grueso puede ser removido por centrifugación o filtración convencional.

• Filtros finos permiten la remoción selectiva de partículas pequeñas como bacterias u organelos celulares.

Diálisis y Cromatografía

• En diálisis, la separación ocurre a través de membranas semipermeables según el tamaño molecular. Este tema será desarrollado más adelante.

• La cromatografía de exclusión separa compuestos durante su paso a través de una matriz gelificada basada en el tamaño molecular.

Cromatografía Intercambio Iónico y Electroforesis

• En cromatografía intercambio iónico, las moléculas se separan según sus cargas al unirse a una matriz cargada opuestamente.

• La electroforesis permite separar partículas cargadas bajo un campo eléctrico; diferentes materiales han sido utilizados como soporte para esta técnica.

Cromatografía de Afinidad y Centrifugación

• En cromatografía de afinidad, las moléculas se separan por unión específica con ligandos inmovilizados.

• Se describirá detalladamente la centrifugación, donde las partículas son alimentadas a velocidades determinadas por su tamaño y densidad.

Tipos y Procesos en Centrifugación

• Existen dos tipos principales: centrifugación preparativa (aislar partículas específicas) y analítica (estimar propiedades físicas).

• Dentro del proceso preparativo hay dos métodos esenciales: centrifugación diferencial (separar componentes subcelulares secuencialmente según tamaño), destacando la importancia del buffer adecuado.

Centrifugación y Separación de Componentes Celulares

Métodos de separación en centrifugación

• Se utiliza un tubo de centrífuga con una banda estrecha de células sobre una solución salina, donde la densidad del medio aumenta hacia el fondo para estabilizar los componentes sedimentados.

• Los gradientes se generan con materiales inertes como sacarosa, permitiendo que las fracciones formen bandas separadas según su tamaño y forma.

• La centrifugación permite separar componentes celulares basándose en su densidad; se alimenta la muestra a través de un gradiente pronunciado que contiene altas concentraciones de sacarosa o cloruro de cesio.

• Este método es tan sensible que puede diferenciar moléculas marcadas con isótopos radioactivos de aquellas no marcadas, flotando en zonas específicas del gradiente.

Centrifugación diferencial y zonal

• En la centrifugación diferencial, el comportamiento depende de las características físicas (forma, tamaño y densidad) de cada componente; se obtienen fracciones sedimentarias.

• En la centrifugación zonal, se aplica una capa delgada sobre un medio con gradiente de densidad; las partículas se concentran en bandas discretas dependiendo también del coeficiente S.

• Es crucial terminar la centrifugación antes que las partículas lleguen al fondo para evitar mezclas indeseadas entre componentes separados.

Equilibrio sedimentario

• La centrifugación isotécnica utiliza un gradiente continuo durante tiempos prolongados para alcanzar el equilibrio entre fuerzas centrífugas y empuje hidrostático.

• Las partículas alcanzan posiciones estables dentro del gradiente sin llegar al fondo, lo cual proporciona alta resolución en la separación.

Técnicas avanzadas y tipos de centrífugas

• Se requiere ultra centrífugación para formar gradientes autoformados a altas velocidades; esto permite separar componentes exclusivamente por su densidad.

• Un protocolo típico incluye caracterizar fracciones mediante microscopía electrónica y actividad enzimática tras una separación inicial por centrifugación diferencial.

Tipos básicos de centrífugas

• Existen diferentes tipos:

• Centrífuga de mesa: Ideal para pequeñas cantidades (3,000 a 7,000 g).

• Centrífugas refrigeradas: Capacidad mayor (10,000 a 15,000 g).

• Ultra centrífugas: Generan más de 100,000 g; utilizadas para separar macromoléculas y determinar pesos moleculares.

¿Cómo funcionan los rotores en la centrifugación?

Tipos de rotores y sus características

• La densidad de las partículas se puede observar en el medio de la figura, donde se presentan diferentes tipos de rotores.

• Los rotores de ángulo fijo varían entre 14 y 40 grados, alcanzando mayores velocidades que los basculantes.

• Se menciona un tipo específico de rotor que tiene un ángulo fijo cero, alineando los tubos verticalmente.

• Los rotores con ángulo fijo cero pueden alcanzar velocidades muy altas para generar una mayor fuerza centrífuga.

• En la figura presentada, se observan coeficientes de sedimentación y densidades de algunas partículas.

Métodos de separación

• Algunas partículas pueden ser separadas mediante una combinación de centrifugación diferencial y gradiente zonal.