Seminario 2A: técnicas utilizadas para el estudio de proteínas- Gabriel Scicolone

Introducción a las Técnicas de Análisis de Proteínas y Ácidos Nucleicos

Presentación del Seminario

• Gabriel Cicolone, profesor de biología molecular y genética, introduce el seminario sobre técnicas para analizar proteínas y ácidos nucleicos.

• Sofía Martín acompaña en la charla, que se dividirá en dos partes: análisis de proteínas y análisis de ácidos nucleicos.

Obtención de Muestras

• Se discuten diferentes métodos para obtener muestras necesarias para estudios proteicos, como autopsias, biopsias y cultivos celulares.

• La conservación de la estructura celular es importante para ciertas técnicas como inmunocitoquímica e inmunofluorescencia.

• Para análisis bioquímico, se pueden usar muestras sin conservar la estructura, como plasma o tejido homogeneizado.

Técnicas Específicas para el Análisis de Proteínas

• Se mencionan varias técnicas: Western blot, citometría de flujo (aunque no es exclusivamente una técnica proteica), e inmunoistoquímica.

• La proteómica se centra en el análisis del conjunto total de proteínas mediante espectrometría de masas.

Relación entre Técnicas y Expresión Génica

Clasificación según la Expresión Génica

• Las técnicas analizadas incluyen ADN, ARN y proteínas; destacando inmunoistoquímica y Western blot como fundamentales.

• La citometría de flujo utiliza reacciones antígeno-antibody similares a las otras técnicas mencionadas.

Conceptos Clave: Antígenos y Anticuerpos

• Un antígeno es cualquier compuesto que provoca una respuesta inmune; puede ser una macromolécula o un microorganismo.

• Los linfocitos B reconocen antígenos específicos gracias a los anticuerpos en su superficie; estos anticuerpos tienen porciones variables que permiten esta especificidad.

Mecanismos Inmunológicos Relacionados con el Análisis

Respuesta Inmune

• Al reconocer un antígeno, los linfocitos B proliferan y se diferencian en células B memoria (de larga duración) y plasmocitos (que secretan anticuerpos).

• Esta respuesta inmune es fundamental para localizar proteínas en tejidos utilizando la unión entre anticuerpos y antígenos como base del análisis experimental.

Estructura del Anticuerpo

¿Cómo se producen los anticuerpos en los linfocitos B?

Estructura y función de los anticuerpos

• La membrana plasmática de los linfocitos contiene anticuerpos con porciones variables que son específicas para cada tipo de antígeno, permitiendo el reconocimiento del mismo.

• Cada clon de linfocitos B tiene un anticuerpo único que reconoce un determinante antigénico específico, lo que implica una diversidad en la respuesta inmune.

Interacción entre antígenos y linfocitos B

• Los antígenos, como las proteínas, inician respuestas inmunes al ser introducidos en organismos extraños; contienen múltiples porciones reconocibles por diferentes anticuerpos.

• Las distintas porciones de un antígeno se denominan epítopos o determinantes antigénicos, cada uno reconocido por un anticuerpo específico presente en la superficie de un linfocito B.

Proliferación y producción de clones

• Un solo antígeno puede ser reconocido por varios tipos de linfocitos B, cada uno con diferentes anticuerpos específicos. Esto genera una amplia respuesta inmune.

• En laboratorios, se utilizan animales como conejos para introducir antígenos y estimular la producción de diversos clones de linfocitos B que responden a esos determinantes antigénicos.

Formación de células madre y plasmocitos

• La estimulación del sistema inmune lleva a la proliferación de linfocitos B, resultando en células madre y plasmocitos que sintetizan anticuerpos solubles específicos para distintos determinantes antigénicos.

• Cada clon originado a partir de un linfocito B específico produce anticuerpos dirigidos a diferentes epítopos del mismo antígeno, generando así sueros con anticuerpos policlonales.

Obtención y uso de anticuerpos

• Para obtener estos anticuerpos policlonales en laboratorio, se separa el plasma sanguíneo donde residen tras precipitar los glóbulos rojos; esto permite detectar proteínas específicas en tejidos o células.

• Los anticuerpos monoclonales son producidos al inyectar un antígeno en ratones; estos generan clones únicos que pueden ser fusionados con células tumorales para crear hibridomas capaces de producir un solo tipo de anticuerpo.

Ventajas del uso de hibridomas

• La fusión celular da lugar a hibridomas que combinan propiedades productivas (anticuerpo específico) e inmortales (proliferación continua), facilitando la obtención sostenida del mismo tipo de anticuerpo.

Técnicas de Inmunoistoquímica y Anticuerpos

Tipos de Anticuerpos

• Los anticuerpos policlonales son aquellos que reconocen múltiples determinantes antigénicos (epítopes) del mismo antígeno, mientras que los monoclonales son específicos para un solo determinante antigénico.

Localización de Proteínas en Tejidos

• La técnica de inmunoistoquímica permite localizar la distribución de proteínas en tejidos, identificando su ubicación específica dentro de las células.

Proceso de Detección

• Para detectar una proteína específica, como un receptor celular, se utilizan anticuerpos que reconocen epítopes particulares. Esto ayuda a determinar cuántas y qué tipo de células expresan esa proteína.

Preparación del Tejido

• Es esencial preservar el material biológico mediante fijación rápida para conservar la estructura celular antes de realizar cortes finos para el análisis microscópico.

Visualización con Anticuerpos Marcados

• Se añade un anticuerpo marcado (con color o fluorocromo) al tejido para identificar la presencia del antígeno específico. Esto permite visualizar dónde se unen los anticuerpos utilizando microscopía óptica o fluorescente.

Métodos de Marcaje

• Los anticuerpos pueden ser marcados con sustancias visibles bajo luz ultravioleta o con colorantes que permiten observar zonas específicas donde se han unido a los antígenos en el tejido.

Estrategia Económica: Inmunoquímica Indirecta

Inmunoistoquímica: Métodos y Aplicaciones

Introducción a la Inmunoistoquímica

• La inmunoistoquímica permite producir anticuerpos secundarios que reconocen porciones constantes de anticuerpos primarios, facilitando la identificación de proteínas en tejidos.

• Se utiliza un anticuerpo secundario marcado que reconoce específicamente los anticuerpos primarios producidos en una especie diferente, como el ratón y el conejo.

Tipos de Inmunoistoquímica

• Existen dos metodologías principales: la inmunoistoquímica directa, donde se marca el anticuerpo primario, y la inmunoistoquímica indirecta, donde se marca el anticuerpo secundario.

• La técnica puede aplicarse a cortes de tejido o células en cultivo, permitiendo observar estructuras sin necesidad de cortarlas.

Especificidad y Detección

• La reacción antígeno-anticuerpo proporciona especificidad para identificar proteínas específicas dentro del tejido o célula analizada.

• Se habla de inmunoistoquímica cuando se estudia la ubicación del antígeno en un tejido; mientras que se refiere a inmunocitoquímica al observar dentro de células cultivadas.

Inmunofluorescencia

• La inmunofluorescencia es un tipo específico de inmunoistoquímica que utiliza fluorocromos para visualizar las reacciones mediante microscopía fluorescente.

• Esta técnica permite detectar antígenos a través del color asociado con los anticuerpos marcados, ya sean primarios o secundarios.

Ejemplos Prácticos

• En cultivos celulares, se observa fluorescencia utilizando un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo verde, indicando localización específica en membranas plasmáticas.

• Se pueden identificar proteínas mitocondriales y nucleares usando anticuerpos específicos para determinar su ubicación exacta dentro de las células observadas bajo microscopía óptica.

Consideraciones Técnicas

• Después de aplicar el anticuerpo, se realizan lavados para eliminar cualquier unión no específica antes de observar la fluorescencia resultante.

Inmunofluorescencia y su Aplicación en la Identificación de Proteínas

Uso de Anticuerpos en Inmunofluorescencia

• Se utilizan anticuerpos específicos: uno contra contractina (ratón) y otro contra la enzima Cox 4 (conejo), permitiendo el uso de dos anticuerpos secundarios distintos.

• La imagen obtenida muestra actina en rojo, la enzima Cox 4 en verde, y ADN en azul, utilizando fluorocromos para identificar cada componente celular.

• Se presenta un esquema que ilustra cómo los anticuerpos marcados con fluorocromos emiten señales observables; se trata de una inmunofluorescencia directa.

Ejemplos Adicionales de Inmunofluorescencia

• En otro ejemplo, se marca el ADN con DAPI (azul), una proteína específica (rojo), y tubulina (verde); se observa mediante microscopía confocal.

• Un anticuerpo secundario con peroxidasa permite identificar proteínas a través de una reacción colorimétrica al agregar un sustrato específico.

Proceso de Inmunoquímica

• La reacción entre antígeno y anticuerpo genera un producto insoluble marrón donde se localiza la proteína; esto permite visualizar células que expresan dicha proteína.

• Comparando inmunofluorescencia e inmunoquímica, ambos métodos permiten determinar distribución molecular pero a diferentes niveles de aumento.

Introducción a Técnicas Alternativas: Western Blot

• Se introduce el Western Blot como otra metodología para identificar proteínas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo, aunque no proporciona información sobre localización.

• El proceso comienza con la obtención de muestras homogeneizadas o plasma para detectar proteínas específicas mediante electroforesis.

Procedimiento del Western Blot

• La técnica implica separar proteínas por tamaño usando electroforesis en gel; las proteínas más grandes migran más lentamente que las pequeñas.

¿Cómo se separan las proteínas en un gel?

Proceso de separación de proteínas

• Se busca separar las proteínas en un gel según su tamaño, utilizando un medio que incluye detergente SDS para rodear a las proteínas con cargas negativas.

• El detergente SDS permite que todas las proteínas tengan carga negativa, facilitando su desnaturalización y estiramiento al romper uniones de disulfuro.

• La muestra de tejido líquido se prepara en una solución que favorece la pérdida de estructura terciaria y cuaternaria, permitiendo que las proteínas se carguen negativamente.

• Se utiliza un gel de poliacrilamida cuya concentración determina el tamaño de los poros; esto es crucial para la separación efectiva durante la electroforesis.

• En el gel, se siembran muestras conocidas junto a la muestra a analizar, lo cual permite identificar las bandas por coloración tras la corrida electroforética.

Corrida electroforética

• Las proteínas corren del cátodo al ánodo a través del gel; las más grandes tardan más en pasar y quedan más arriba, mientras que las más pequeñas corren más rápido hacia el polo positivo.

• Todas las proteínas están cargadas negativamente debido al tratamiento con SDS, lo que asegura su movimiento hacia el polo positivo durante la corrida.

• La técnica permite separar moléculas por peso molecular; se observa cómo distintas proteínas quedan distribuidas a lo largo del gel según su tamaño.

• Al finalizar la corrida, se pueden identificar bandas específicas mediante tinción, lo cual revela información sobre el peso molecular de cada proteína presente en la muestra analizada.

Identificación específica de proteínas

• Para identificar una proteína específica entre todas las separadas (por ejemplo, un receptor), se utiliza un anticuerpo específico que reconoce dicha proteína.

• Se añade primero un anticuerpo primario seguido por uno secundario marcado; este último generalmente contiene una enzima que produce un producto coloreado visible tras reacción con sustrato.

Transferencia y localización

• Un desafío es conservar la ubicación del producto resultante en el gel. Por ello, es necesario transferir las proteínas a una superficie sólida como papel de nitrocelulosa para evitar dispersión del producto reactivo.

Técnica de Western Blot

Proceso de Transferencia de Proteínas

• La técnica de transferencia o blot implica colocar un gel con proteínas junto a una membrana de nitrocelulosa, utilizando un medio acuoso y electricidad para transferir las proteínas cargadas negativamente del gel a la membrana.

• Después de la transferencia, se separa la membrana y se añade un anticuerpo que se une a la proteína de interés. Se utiliza un anticuerpo secundario marcado para detectar esta unión.

• Al agregar un sustrato al anticuerpo secundario, se genera un producto que precipita en la zona donde está la proteína, permitiendo su visualización.

Detección y Análisis

• La presencia o ausencia de una banda en el Western Blot indica si la proteína buscada está presente. Además, se puede determinar su peso molecular comparando con controles.

• La intensidad y grosor de la banda proporcionan información sobre la cantidad relativa de proteína en el tejido analizado.

Fundamentos del Western Blot

• El término "Western Blot" proviene del uso de transferencia (blotting) y reacciones antígeno-anticuerpo (inmuno). Se diferencia de técnicas similares como Southern Blot (ADN) y Northern Blot (ARN).

• Southern Blot identifica ADN mediante hibridación con oligonucleótidos; Northern Blot localiza ARN usando principios similares al Southern.

Ejemplo Práctico

• En una corrida con estándares moleculares, se observan bandas en algunas muestras indicando presencia de proteínas específicas. Esto permite concluir sobre su existencia en los homogenatos analizados.

• El análisis también revela diferencias en intensidad entre bandas, sugiriendo variaciones en las cantidades relativas presentes en cada muestra.

Fraccionamiento Subcelular

• Para conocer la ubicación específica dentro del tejido, es necesario realizar fraccionamiento subcelular antes del análisis por Western Blot. Esto incluye centrifugaciones diferenciales para separar componentes celulares como núcleos y mitocondrias.

• Cada fracción celular puede ser analizada individualmente mediante Western Blot para identificar dónde se encuentra específicamente una proteína dentro del homogenato original.

Conclusiones sobre Localización

• Si bien el homogenato puede mostrar presencia total de proteínas, el fraccionamiento permite identificar concentraciones más altas en ciertas fracciones como microsomas comparado con citosol.

• Sin fraccionamiento subcelular previo, solo se puede determinar si hay presencia o no de proteínas sin conocer su distribución exacta dentro del tejido analizado.

Técnicas de Detección de Proteínas

Comparación de Muestras con Ecaderina y Actina

• La ecaderina permite comparar cuatro muestras, donde tres contienen ecaderina y una no. Se observa que la primera muestra tiene más cantidad que la segunda.

• Para calcular la cantidad relativa de ecaderina, se compara su intensidad con una banda de control (actina), lo que proporciona un cociente que indica la relación entre ambas proteínas.

Inmunoistoquímica y Western Blot

• Ambas técnicas (inmunoistoquímica e inmunofluorescencia, y western blot) dependen de la reacción antígeno-anticuerpo para detectar proteínas.

• Una limitación del western blot es que puede marcar múltiples bandas, indicando falta de especificidad en la reacción entre anticuerpos y antígenos.

Uso de Proteínas Fluorescentes

• Se pueden utilizar proteínas fluorescentes para estudiar su distribución en tejidos; esta técnica se abordará en la segunda parte del seminario sobre ADN.

Resumen de Técnicas Vistas

• Se ha visto cómo usar inmunoistoquímica para localizar proteínas dentro de células o tejidos, así como el uso del western blot para detectar presencia y cantidad relativa sin ubicación específica.

• El fraccionamiento subcelular es necesario para conocer la distribución precisa de las proteínas en los tejidos analizados.

Citometría de Flujo

• La citometría de flujo permite separar e identificar características celulares utilizando reacciones antígeno-anticuerpo.

• En esta técnica, las células pasan por un flujo líquido donde se marcan con fluorocromos; esto ayuda a distinguir entre células marcadas y no marcadas.

Análisis mediante Láser

• Las células atraviesan un rayo láser que provoca desviaciones y emisiones lumínicas dependiendo si tienen o no el fluorocromo.

• Existen dos detectores: uno para fluorescencia (células con fluorocromo) y otro para luz desviada (que atraviesa todas las células).

Separación Celular por Carga Electromagnética

• Al agregar carga a las células marcadas, se pueden separar las fluorescentes (con carga) de las no fluorescentes (sin carga).

Análisis de Células mediante Citometría de Flujo

Detección y Clasificación de Células

• Se utiliza un detector para analizar cómo el rayo luminoso atraviesa las células, permitiendo evaluar la granulosidad y el tamaño celular.

• Las células se distribuyen en un gráfico según su tamaño y cantidad de gránulos, facilitando la separación morfológica entre diferentes tipos celulares.

• La citometría de flujo permite distinguir granulocitos, monocitos y linfocitos basándose en características morfológicas y reacciones inmunológicas.

• A través de la técnica se obtiene información sobre marcadores específicos presentes o ausentes en las células analizadas.

• Se mencionan técnicas complementarias como inmunocitoquímica e inmunofluorescencia que enriquecen el análisis celular.

Técnicas Proteómicas

• Se introducen técnicas proteómicas que permiten analizar un número mayor de proteínas en comparación con métodos anteriores como western blot.

• La proteómica ofrece una visión general del conjunto total de proteínas expresadas en sistemas biológicos, ya sean células, tejidos u órganos completos.

• La base fundamental de estas técnicas es la espectrometría de masa, que analiza proteínas según su carga y masa.

Proceso Espectrométrico

• El proceso comienza con la creación de un homogenato donde se cortan las proteínas en péptidos utilizando enzimas específicas.

• Los péptidos son purificados mediante cromatografía o electroforesis para lograr una separación relativa antes del análisis final.

• En el espectrómetro de masa, los péptidos son ionizados y se mueven a distintas velocidades dependiendo de su masa, lo cual permite su análisis detallado.

• Los resultados se representan gráficamente según el cociente masa/carga; picos más altos indican mayor cantidad relativa de proteína presente.

Análisis del Patrón de Expresión Proteica

Importancia de la Expresión Génica

• La diferencia entre tejidos y su desarrollo se basa en la expresión génica diferencial, lo que implica que diferentes conjuntos de genes son expresados en distintos tejidos.

• El resultado final de esta expresión es el patrón de proteínas, que proporciona información sobre las proteínas presentes en un tejido o célula en un momento específico.

Métodos para el Análisis Proteico

• Para identificar y cuantificar proteínas, se utilizan dos pasos: separación inicial y análisis mediante espectrometría de masas.

• La electroforesis bidimensional es una técnica clave para separar proteínas por pH y peso molecular antes del análisis.

Técnicas de Purificación

• Se pueden utilizar métodos como cromatografía líquida para separar proteínas según su tamaño o carga, facilitando así su posterior análisis.

• En cromatografía líquida, las proteínas más grandes tardan más en pasar a través del medio filtrante, permitiendo su separación efectiva.

Espectrometría de Masas

• En la espectrometría de masas, las muestras son ionizadas y aceleradas hacia un detector; esto permite obtener gráficos que representan los diferentes péptidos según su velocidad.

• Los resultados permiten conocer no solo qué proteínas están presentes sino también sus cantidades relativas en la muestra analizada.

Fraccionamiento Subcelular

• A través del fraccionamiento subcelular se obtienen péptidos específicos que pueden ser analizados para determinar la cantidad y tipo de proteínas presentes.

Análisis de Proteínas en Sistemas Biológicos

Técnicas para el Análisis de Proteínas

• Se concluye que, tras el análisis de segmentos peptídicos, se puede determinar qué proteínas y en qué cantidades están presentes en un sistema biológico.

• Se presentan dos técnicas principales: la inmunocitoquímica, que permite detectar la distribución de una proteína en tejidos o células, y el western blot, que identifica la presencia y cantidad relativa de una proteína.

• El western blot generalmente se realiza a partir de homogenatos o muestras de plasma; sin embargo, para conocer la distribución dentro del tejido homogeneizado es necesario realizar un análisis celular.

• La citometría de flujo permite analizar células a medida que pasan por un flujo líquido y son evaluadas mediante láser según su emisión luminosa. Esto facilita la separación entre células marcadas y no marcadas.

• La proteómica ofrece un análisis global de las proteínas expresadas en un tejido en un momento dado, contrastando con las técnicas anteriores que se enfocan en proteínas individuales.

Fundamentos y Utilidades de las Técnicas