Introducción a la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
Resumen de la Sección: En esta sección, se introduce la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y se explican sus fundamentos básicos.
La Importancia de la PCR
La PCR, o Reacción en Cadena de la Polimerasa, es una técnica utilizada en biología molecular para amplificar rápidamente fragmentos específicos de ADN con una cantidad mínima inicial.
: Fue ideada por el bioquímico Kary Mullis en 1983 y le valió el Premio Nobel de Química.
Los ingredientes básicos para preparar una reacción de PCR son:
Fragmento de ADN molde que se desea amplificar.
Cebadores complementarios a las hebras del ADN molde.
ADN polimerasa termoestable, como la Taq polimerasa.
Iones bivalentes como magnesio o manganeso que ayudan a la actividad de la ADN polimerasa.
Proceso y Ciclos de la PCR
Una reacción típica de PCR consta de 25 a 45 ciclos, cada uno con dos o tres pasos o cambios de temperatura.
El primer ciclo inicia con la desnaturalización del ADN, separando las dos hebras a unos 94 grados centígrados.
Luego sigue la hibridación a una temperatura más baja donde los cebadores se unen al ADN molde complementario.
Finalmente, ocurre la elongación donde la ADN polimerasa sintetiza una cadena complementaria al molde.
Aplicaciones y Versatilidad de la PCR
Resumen de la Sección: En esta parte se exploran las diversas aplicaciones y adaptaciones posibles de la técnica PCR en diferentes campos científicos.
Aplicaciones Clave
La técnica PCR se utiliza rutinariamente en áreas como investigación, medicina diagnóstica, paleontología y ciencias forenses.
: Ejemplo: Estudio viral en muestras humanas mediante amplificación selectiva del genoma viral.
Adaptabilidad y Variaciones
Existen numerosas variaciones posibles en el protocolo básico de PCR:
Modificaciones menores o cambios en componentes como tipo y concentración de polimerasa e iones bivalentes.
Adición posible de pasos antes o después según necesidades específicas; por ejemplo, trabajar con ARN en lugar de ADN.
Versatilidad Amplia
Video description
En este vídeo explico qué es y cómo funciona la PCR. Veremos también cuales son las aplicaciones de esta técnica y plantearé un ejemplo práctico para acabar de asentar la información comentada.
CONTENIDO DEL VÍDEO
La famosa PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa en castellano, es una técnica comúnmente usada en biología molecular para multiplicar rápidamente un fragmento específico de ADN empezando con una cantidad mínima de este. Aunque ideas similares asomaban en 1971(1), la PCR fue ideada por el bioquímico Kary Mullis en 1983, lo que le valió el premio Nobel de química una década más tarde.(2)
La importancia de esta técnica resta en que, mediante una cantidad muy pequeña de una molécula de ADN de interés, podemos conseguir millones de copias, pero ¿cómo lo hacemos? Los ingredientes básicos para preparar una reacción de PCR son: 1) el fragmento de ADN molde, que queremos amplificar; 2) desoxinucleótido-trifosfatos (dNTPs) o, dicho de otra forma, las piezas básicas de una molécula de ADN; 3) dos cebadores complementarios a las hebras del ADN molde; 4) ADN polimerasa, una enzima encargada de sintetizar moléculas de ADN a partir de dNTPs. Esta enzima tiene que ser termoestable, por eso la más comúnmente usada es la Taq polimerasa. 5) iones bivalentes, como Magnesio o Manganeso, que ayudan al trabajo de la ADN polimerasa (3).
¡Una vez conocemos los ingredientes básicos, vamos a preparar el cóctel! Una reacción de PCR consta de 25-45 ciclos. Cada ciclo consistirá en 2-3 pasos o cambios de temperatura, en este ejemplo usaremos 3 cambios de temperatura por ciclo. ¡Empecemos con el primer ciclo! A) El paso inicial consiste en la desnaturalización del ADN o, dicho de otra forma, la separación de las 2 hebras que lo componen. Este paso suele realizarse a una temperatura de 94ºC. B) El siguiente paso es la hibridación, la cual sucede a una temperatura más baja; esta temperatura dependerá de los cebadores, pero suele ser entre 45-68ºC y suele durar de 15-60 segundos. En este paso los cebadores se unirán a su secuencia complementaria del ADN molde. C) El paso final del ciclo es la elongación. En este, la ADN polimerasa sintetizará una cadena complementaria al ADN molde utilizando los dNTPs libres. La síntesis tomará como punto de inicio el cebador y trabajará en dirección 5’ - 3’. La temperatura de este paso dependerá de la ADN polimerasa usada, en el caso de la Taq polimerasa necesitaremos temperaturas de aproximadamente 68ºC.
Los pasos de desnaturalización, hibridación y elongación constituyen un ciclo. Después del último ciclo y para asegurarnos que todo el ADN ha sido amplificado, se realiza una elongación final, que dura entre 5 y 15 minutos. Una vez finalizada la reacción, esta se puede conservar por un tiempo indefinido a 4ºC (4).
Una vez conocemos como funciona la PCR, hablemos de sus aplicaciones. Esta técnica se usa rutinariamente en distintas áreas como: en investigación, en medicina con fines diagnósticos (5), en paleontología (6,7), en ciencias forenses (7). Para ilustrarlo mejor veamos un ejemplo: Imaginemos que queremos estudiar la presencia de un virus en una muestra humana. Si conocemos el genoma del virus, lo primero que debemos hacer es buscar una región que sea específica de éste y que no encontremos en el genoma humano. Una vez tenemos esta región, diseñaremos distintos cebadores para poder amplificarla. En el caso que la persona esté infectada por el virus, mediante una PCR podremos amplificar y detectar la región del ADN viral previamente seleccionada mientras que, si esta persona no se encuentra infectada, a falta de un ADN molde, no habrá amplificación de material genético.
Aunque en este vídeo hemos cubierto los conceptos básicos de la PCR, existen decenas de variaciones de esta técnica. Podemos hacer pequeñas modificaciones en el protocolo básico (8-10) o bien podemos cambiar componentes, como la polimerasa usada o la concentración de iones bivalentes (11-13); incluso es posible añadir pasos antes o después de la reacción de PCR como, por ejemplo, en caso de trabajar con ARN en vez de ADN (14). Como hemos visto, la PCR es una técnica increíblemente versátil y con infinidad de aplicaciones en distintos campos.
REFERENCIAS
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