Seminario 11 Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Entidades Monogénicas - Sebastián Giusti

Introducción a la Biología Molecular en Genética Médica

Contexto y Objetivos de la Clase

• La clase se centra en técnicas de biología molecular aplicadas a la genética médica, enfocándose en detectar variantes alélicas en el genoma.

• Se dividirá en dos partes: primero, se analizarán las variantes de la técnica PCR; segundo, se explorarán técnicas basadas en secuenciación de ADN.

Fundamentos de la Técnica PCR

• La técnica PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), desarrollada por Carry Mulis en los años 80, permite amplificar segmentos específicos de ADN a partir de mezclas complejas.

• Esta técnica es crucial para reproducir reacciones químicas que implican polimerización de ácidos nucleicos, comenzando con un molde extenso como el ADN genómico total.

Componentes Esenciales para PCR

• Los elementos necesarios incluyen:

• ADN genómico del paciente como molde.

• Enzima ADN polimerasa (TAC polimerasa), que es termorresistente.

• DNTPs (deoxynucleotides triphosphates): adenina, timina, citosina y guanina como sustratos.

Función y Requerimientos de los Primers

• Los primers son esenciales para iniciar la reacción; actúan como cebadores que permiten a la ADN polimerasa comenzar su trabajo.

• Además, determinan qué segmento específico del ADN será amplificado durante el proceso.

Proceso General de Amplificación por PCR

• La reacción consiste en ciclos que incluyen:

• Desnaturalización del ADN a 95ºC para separar las hebras.

Proceso de Amplificación del ADN mediante PCR

Pasos en la Reacción de PCR

• La reacción comienza con la hibridación de los primers a las hebras de ADN, que ocurre a una temperatura más baja.

• En el tercer paso, a 72°C, se lleva a cabo la elongación y polimerización efectiva por parte de la TAC polimerasa.

• Este proceso se repite en ciclos, generando una amplificación exponencial del ADN; cada ciclo duplica la cantidad de molde disponible.

• Después de aproximadamente 30 ciclos, se pueden obtener miles de millones de copias del segmento específico de ADN amplificado.

Visualización del Producto Amplificado

• Para visualizar los productos amplificados, se utiliza electroforesis en gel, donde las moléculas cargadas migran bajo un campo eléctrico.

• Las moléculas de ácidos nucleicos son negativas debido a sus grupos fosfato y migran hacia el electrodo positivo en un gel poroso.

• Los fragmentos más pequeños atraviesan el gel con mayor facilidad que los más grandes, permitiendo su separación según tamaño.

Uso del Bromuro de Etidio

• Se emplea bromuro de etidio como intercalante para visualizar el ADN; emite fluorescencia al ser iluminado con luz ultravioleta.

• Al revelar el gel con luz UV después de añadir bromuro de etidio, aparecen marcas fluorescentes donde hay ADN presente.

Interpretación y Análisis

• En un gel típico se siembran marcadores para estimar tamaños moleculares; esto ayuda a comparar productos amplificados obtenidos en diferentes reacciones.

• A veces no hay producto visible; esto puede indicar fallas en la reacción o ausencia del objetivo deseado.

Alternativas a la Electroforesis Convencional

• Existen métodos alternativos como la electroforesis capilar que utilizan tubos delgados para separar moléculas bajo un campo eléctrico similar.

• En este método también se detectan picos fluorescentes que representan lo que serían bandas en un gel convencional.

• El resultado es presentado digitalmente como un electroferograma donde los picos indican intensidad y tamaño molecular.

Ejemplo Práctico

Técnica de PCR y su Aplicación en Genética Médica

Fundamentos de la Técnica de PCR

• La técnica de PCR puede generar productos de amplificación distintos, observables como picos en un gráfico.

• Se revisan los reactivos básicos y modos de visualización en una reacción de PCR, enfocándose en su uso en genética médica para detectar variantes alélicas.

Importancia del Contexto Clínico

• La PCR es una técnica basada en hipótesis; se utiliza para buscar variantes alélicas específicas relacionadas con condiciones clínicas.

• Ejemplo: En fibrosis quística, se busca una mutación específica en el gen CFTR que causa síntomas clínicos.

Ejemplo Práctico: Fibrosis Quística

• La fibrosis quística se caracteriza por taponamiento mucoso y es causada por variantes patogénicas en el gen CFTR, siendo la más común la deleción de fenilalanina 508.

• Esta deleción afecta negativamente la función proteica, lo que hace relevante su detección mediante PCR.

Diseño de Primers y Detección

• Para detectar deleciones o inserciones, se diseñan primers basados en la secuencia del genoma humano alrededor del sitio específico a investigar.

• Los primers pueden unirse a ambas variantes alélicas, generando amplicones que permiten distinguir entre ellas según su tamaño.

Análisis de Resultados

• Al comparar productos amplificados, las diferencias mínimas (como tres nucleótidos) pueden ser analizadas usando geles poliacrilamida para discriminar entre variantes.

Detección de Variantes Alélicas mediante PCR

Amplificación y Productos de PCR

• Se discute la amplificación de productos generados por variantes alélicas en una reacción de PCR, donde algunos individuos presentan un solo producto, mientras que otros muestran dos productos de diferentes tamaños.

• En los individuos con dos productos, se sugiere que uno podría tener una delesión en heterocigosis, lo que implica variaciones en el tamaño del amplicón.

Detección de Mutaciones por Sustitución

• Para detectar variantes alélicas causadas por mutaciones de sustitución, se requieren técnicas específicas ya que no habrá diferencias en el tamaño del producto amplificado.

• La PCR aleloespecífica es una técnica diseñada para identificar estas sustituciones. Se basa en el diseño específico de primers que se unen a variantes alélicas distintas.

Diseño de Primers Aleloespecíficos

• El diseño debe asegurar que un primer se una específicamente a una variante alélica; si hay un mal apareamiento, la amplificación no ocurrirá para esa variante.

• Esto permite inferir cuál variante está presente basándose en la presencia o ausencia del producto amplificado durante la reacción.

Análisis de Resultados Electrofóreticos

• Al analizar los resultados electroforéticos, se puede determinar qué pacientes tienen ciertas variantes alélicas. Por ejemplo, los pacientes 1, 2 y 5 mostraron amplificación para la variante CG.

• Los individuos 3 y 4 inicialmente no mostraron señal pero luego revelaron tener la variante AT tras realizar otra PCR con primers específicos para esta variante.

Configuración Genética y Otras Técnicas

• Un individuo con amplificación en ambas pruebas probablemente sea heterocigoto (CG y AT). Se invita a reflexionar sobre el estado genético del individuo 5 basado en sus resultados.

• Se introduce la técnica PCR RFLP para detectar mutaciones puntuales mediante enzimas de restricción. Esta técnica permite distinguir entre variantes alélicas basándose en su capacidad para ser cortadas por enzimas específicas.

Aplicación Práctica y Consideraciones Finales

• La identificación precisa requiere conocer las secuencias reconocidas por las enzimas. Si una variación afecta un sitio reconocido por una enzima específica, esto puede ser utilizado para diferenciar variantes alélicas.

Análisis de Variantes Alélicas mediante PCR

Diseño de Primers y Amplificación

• Se diseñan primers que flanquean el sitio de restricción donde se encuentra la variante alélica. Estos primers no afectan la región polimórfica, permitiendo amplificar ambas variantes.

• La amplificación por PCR genera productos del mismo tamaño para las dos variantes alélicas, lo que es crucial para el siguiente paso en el análisis.

Tratamiento con Enzimas de Restricción

• Al tratar los productos amplificados con enzimas de restricción, solo uno de los fragmentos puede ser cortado dependiendo de si la variante afecta el sitio de restricción.

• Esto resulta en un polimorfismo en la longitud de los fragmentos, permitiendo su separación mediante electroforesis.

Interpretación de Resultados

• En cinco pacientes analizados, se observó que la variante alélica AT conservaba el sitio de restricción y generaba dos fragmentos más pequeños, mientras que TA generaba un único fragmento más largo.

• El paciente cuatro tenía una variante TA (fragmento grande), mientras que el individuo uno presentaba solo variantes AT (dos fragmentos pequeños).

Casos Complejos y Variantes Mixtas

• Los individuos tres y cinco mostraron tres productos en gel; esto indica una combinación única de variantes TA (no cortada) y AT (cortada).

Aplicaciones Forenses de la PCR Multiplex

Contexto Genético Forense

• La PCR multiplex se utiliza para determinar relaciones biológicas entre individuos a través del análisis genético, no necesariamente patológico.

Microsatélites como Herramienta Analítica

• Se exploran regiones polimórficas del genoma llamadas microsatélites o STRs. Cada persona tiene variantes maternas y paternas en estas posiciones repetitivas.

Estándares del FBI para Análisis Genéticos

• Desde 1997, el FBI estandarizó un procedimiento que analiza 13 secuencias diferentes para aumentar la fidelidad en estudios de filiación.

Técnica Avanzada: PCR Multiplex

Visualización de Productos de Amplificación en PCR

Fluoróforos y Diferenciación de Productos

• Se utilizan fluoróforos para visualizar productos de amplificación en PCR, permitiendo diferenciar los productos por color.

• La técnica combina PCR multiplex con electroforesis capilar para detectar diferentes productos a través de fluorescencias emitidas por distintos colores.

Análisis del Electroferograma

• En el electroferograma se observan picos de diferentes colores que representan la intensidad de fluorescencia y el tamaño del amplicón.

• Las señales digitales pueden separarse por color, facilitando un análisis detallado de los productos amplificados.

Ejemplo Práctico con Microsatélites

• Al analizar microsatélites, se pueden identificar múltiples picos que indican diferentes números de repeticiones en un individuo.

• Un único pico indica que las variantes alélicas materna y paterna tienen el mismo número de repeticiones.

Comparación Genética

• Combinando información sobre múltiples pares de primers, se puede determinar el número exacto de repeticiones y evaluar la afiliación biológica entre individuos.

TPPCR: Diagnóstico Genético por Expansión de Tripletes

Características del TPPCR

• La TPPCR se utiliza para diagnosticar enfermedades genéticas asociadas a expansiones tripletales dentro del gen afectado.

• Existen variantes alélicas normales (5 a 50 repeticiones), así como premutaciones que no presentan síntomas pero tienen riesgo elevado en gametas.

Limitaciones de la PCR Convencional

• La PCR convencional tiene dificultades para detectar expansiones tripletales debido a errores en la amplificación causados por regiones repetitivas complejas.

Ejemplo del Gen FMR1

• El gen FMR1 presenta expansiones difíciles para la ADN polimerasa, lo que puede resultar en fallas durante la amplificación.

Consecuencias Clínicas

Técnicas de Amplificación y Análisis de Variantes Alélicas

Problemas con la Amplificación de Variantes Alélicas

• La amplificación de variantes alélicas expandidas puede resultar en un producto no visible, ya que solo se observa el producto de la variante no expandida, lo que genera resultados enmascarados.

• La técnica tradicional de Southern blot está siendo reemplazada por variaciones de PCR para abordar estos problemas, permitiendo una mejor detección.

Adaptación de la Técnica PCR

• Se utiliza una variante de PCR que emplea tres primers: uno forward en la región flanqueante, uno complementario a las repeticiones y un reverse que se une a la hebra opuesta.

• Esta configuración permite generar productos de amplificación diversos debido a la unión del primer a diferentes lugares dentro de las repeticiones.

Resultados y Análisis mediante Electroforesis Capilar

• La técnica permite estimar variantes alélicas expandidas mediante dos metodologías: observando productos completos y fragmentos de distintos tamaños.

• Los resultados son analizados con electroforesis capilar, donde los electroferogramas muestran picos que reflejan intensidad y tamaño del producto amplificado.

Interpretación del Electroferograma

• En el caso normal, se observa un intenso pico correspondiente a la variante alélica normal junto con picos adicionales generados por el primer en regiones repetitivas.

• Para variantes premutadas, hay un rango más amplio en los picos y una señal más fuerte del producto mayor debido a errores incrementales durante la amplificación.

Comparación entre Diferentes Tipos de Variantes Alélicas

• En portadores con expansión completa, el rango molecular es más amplio pero con menor altura del pico principal, indicando menor eficiencia en su producción.

Métodos de Secuenciación: Sanger y su Evolución

Introducción al Método de Sanger

• Se analiza el método de secuenciación desarrollado por Frederik Sanger, quien ganó el Premio Nobel de Química en 1980. Este método fue fundamental para la primera secuenciación del genoma humano en el contexto del proyecto genoma humano.

Metodologías de Alto Rendimiento

• Se discuten desarrollos recientes (últimos 15 a 20 años) que se basan en el método de Sanger, conocidos como metodologías de secuenciación de alto rendimiento o "next generation sequencing".

Bioquímica de la Polimerización

• Para entender la metodología de Sanger, es crucial revisar los mecanismos moleculares implicados en la polimerización de ácidos nucleicos. La ADN polimerasa utiliza una hebra simple como molde y no puede iniciar la polimerización desde cero.

Variantes Nucleotídicas Utilizadas por Sanger

• Sanger ideó usar variantes nucleotídicas que impiden la continuación del proceso de polimerización. Estas son los dideoxi ribonucleótidos trifosfato, que carecen del grupo hidroxilo en posición tres prima.

Proceso Experimental

• En una reacción in vitro, se añaden dideox nucleótidos marcados con fluoróforos diferentes junto con DNTPs normales. Esto permite identificar cuándo se detiene la polimerización debido a un dideoxi nucleótido incorporado.

Diseño del Experimento

• Se introduce un fragmento conocido al extremo del ADN a secuenciar para diseñar un primer complementario que inicie la polimerización. Esto es esencial para determinar la secuencia desconocida.

Reacción Paralela y Resultados

• La reacción ocurre millones de veces simultáneamente dentro del tubo, lo que aumenta las probabilidades de completar varias reacciones exitosas. Sin embargo, algunas moléculas pueden incorporar un dideoxi nucleótido al azar, terminando así su polimerización.

Proceso de Polimerización y Secuenciación de ADN

Polimerización y Mezcla Compleja

• La polimerización genera una mezcla compleja de moléculas, donde algunas están completamente polimerizadas y otras tienen diferentes longitudes debido a interrupciones en el proceso.

• La participación de millones de moléculas en la polimerización sugiere que es probable encontrar un subconjunto representado en cada posición del ADN.

Separación por Electroforesis

• Las moléculas resultantes variarán en longitud, lo que permite su separación mediante electroforesis, utilizando matrices porosas como geles de agarosa.

• Al separar los fragmentos según su tamaño, se puede identificar el nucleótido final mediante fluorescencia, facilitando la reconstrucción de la secuencia.

Análisis de Electroferogramas

• Los resultados se presentan como electroferogramas con picos que indican diferencias en nucleótidos; cada pico corresponde a un fragmento distinto del ADN.

• Cada fluoróforo utilizado reporta uno de los cuatro nucleótidos del ADN, permitiendo obtener digitalmente la secuencia tras el análisis capilar.

Variantes Alélicas y Heterocigosidad

• Se pueden distinguir variantes alélicas entre individuos; un individuo puede mostrar dos picos simultáneos indicando heterocigosidad en una misma posición genética.

• Este fenómeno refleja que las variantes alélicas maternas y paternas pueden diferir, resultando en múltiples picos para un mismo nucleótido.

Limitaciones y Avances en Secuenciación

• La secuenciación Sanger tiene limitaciones: solo se analiza una clase molecular a la vez y sus costos son relativamente altos.

Técnicas de Secuenciación en Genética Médica

Variantes Genómicas y su Relación con Patologías

• En el contexto de la genética médica, se presentan muchas variantes respecto al genoma humano de referencia, lo que dificulta determinar si estas variaciones son causales para patologías o simplemente variantes no patogénicas que reflejan la diversidad genética de la población.

Subconjuntos del Genoma

• La técnica de secuenciación no solo permite analizar el genoma completo, sino también subconjuntos específicos, como las regiones exónicas, que son más pequeñas y se centran en las variaciones en las áreas codificantes del genoma.

Diagnóstico Molecular y Hipótesis Clínicas

• En el diagnóstico molecular de entidades monogénicas, es crucial considerar los signos y síntomas del paciente para formular una hipótesis sobre un gen específico responsable de su condición. Esto puede guiar el uso de técnicas adecuadas para el diagnóstico.

• Si hay una fuerte hipótesis clínica basada en antecedentes familiares o síndromes conocidos, se pueden utilizar técnicas específicas; sin embargo, si no existe tal hipótesis, se recomienda usar métodos libres de sesgo como la secuenciación de alto rendimiento.

Evaluación de Variantes Causales

• Al encontrar variantes que difieren del genoma humano de referencia durante la secuenciación, es posible elaborar hipótesis sobre su causalidad. Esto puede corroborarse si se encuentra la misma variante en otros individuos con síntomas similares o si hay evidencia funcional negativa asociada a esa variante.

Estrategias Basadas en Mutaciones Conocidas

• Si existen mutaciones frecuentemente descritas para un gen particular relacionado con una enfermedad específica, se pueden emplear técnicas más dirigidas como la secuenciación Sanger para investigar esas mutaciones específicas.

• En caso contrario, donde no hay mutaciones conocidas frecuentes, sería necesario realizar análisis más amplios utilizando PCR convencional u otras metodologías según la naturaleza de las mutaciones buscadas.

Aplicaciones Forenses y Técnicas Especializadas