Video 4 IGV Mariana Funari

Introdução à Ferramenta IGV

Apresentação da Palestrante

• Mariana, biomédica e biologista no L 42, responsável pelo setor de sequenciamento.

• Colaboradora do Cela, uma das facilites de sequenciamento em larga escala da faculdade de medicina.

Objetivo da Aula

• Apresentar a ferramenta IGV para visualização de variantes identificadas em sequenciamento em larga escala.

• Diferenciar entre resultados de sequenciamento por sangue e listas de variantes geradas por ferramentas específicas.

Funcionamento do IGV

Visualização das Variantes

• O IGV permite visualizar variantes e verificar a cobertura nas regiões genômicas.

• A altura dos picos na visualização indica a profundidade da cobertura; áreas cinzas representam regiões não cobertas.

Versões do Software

• O IGV possui versão desktop (instalável) e versão web (usável no navegador).

• A interface inclui um manual do usuário e links para vídeos com dicas sobre análise.

Importação e Análise de Dados

Seleção do Genoma Referência

• Primeiro passo é selecionar o genoma referência utilizado na análise (ex: hg19 ou hg38).

Importação dos Arquivos

• Os arquivos preferenciais são os arquivos BAM, que devem ser alinhados ao genoma referência.

Navegação e Busca no IGV

Localizando Variantes Específicas

• É possível buscar coordenadas específicas para visualizar variantes diretamente.

Análise da Cobertura

• A cobertura pode ser verificada clicando nas regiões coloridas; informações sobre quantas vezes foram sequenciadas estão disponíveis.

Configurações Avançadas

Modificação das Preferências

• Usuários podem ajustar critérios como o range de visibilidade e fração do alelo para chamar variantes.

Visualização Detalhada dos Genes

• Ao clicar nos genes, é possível acessar informações detalhadas sobre exons e transcritos principais.

Análise Final das Variantes

Identificação de Variantes Heterozigóticas

Análise de Reads em Sequenciamento

Agrupamento e Visualização de Reads

• O agrupamento dos reads pode ser feito por diversos critérios, permitindo a seleção e coloração dos mesmos. Por exemplo, no sequenciamento paired-end, os reads sense são marcados em vermelho e os antisense em azul.

• É possível visualizar deleções nas sequências. Uma deleção de uma única base aparece como uma barra preta no meio do read, enquanto uma deleção maior (como 16 nucleotídeos) é representada por uma diminuição brusca na cobertura.

• Inserções são indicadas com um símbolo roxo (Z), mostrando quantas bases foram inseridas e quais são essas bases. Neste caso específico, três bases foram inseridas.

Análise de Cobertura e Viés de Fita

• A coloração dos reads ajuda a identificar regiões de baixa cobertura. Em casos onde a variante está presente apenas nas sequências antisense, isso pode levar a falsos positivos na chamada de variantes.

• A visualização dos pares de reads é crucial para entender variantes próximas que não estão localizadas no mesmo read, mas dentro do mesmo fragmento da biblioteca.

Identificação de Variantes em Genes Candidatos

• Quando se analisa doenças autossômicas recessivas, o sequenciamento pode fornecer informações sobre heterozigose composta sem necessidade da segregação nos pais.

• Em casos onde não há variante detectada em um gene candidato forte, é importante verificar variantes comuns associadas à doença através das coordenadas no dado do sequenciamento.

Exemplo Prático: Síndrome de McCune-Albright

• No caso da síndrome de McCune-Albright, duas variantes frequentes no gene GNAS foram analisadas. Apesar da baixa frequência no sangue periférico devido ao mosaico celular, foi possível confirmar a presença da variante através de PCR digital após análise mais sensível.

Importância da Cobertura Genômica

• Ao analisar genes candidatos sem variantes patogênicas identificáveis, observar a cobertura geral do gene pode revelar quedas significativas que indicam possíveis deleções ou problemas na sequência.

• O IGV (Integrative Genomics Viewer) marca reads com cores específicas para indicar qualidade; por exemplo, cores brancas sinalizam baixa qualidade de mapeamento devido à homologia com pseudogenes.

Considerações Finais sobre Qualidade dos Dados

Análise de Rearranjos Estruturais em Sequenciamento Genético

Identificação de Rearranjos Estruturais

• O sequenciamento por end permite inferir a distância entre os reads sense e anti-sense, ajudando na identificação de rearranjos estruturais.

• Em casos de deleções, há uma perda de segmentos do cromossomo, resultando em aproximação dos reads que são visualizados com cores diferentes no programa.

• A fusão entre cromossomos é identificada pela coloração distinta dos reads provenientes de cada cromossomo, indicando que estão juntos.

• Inversões também geram padrões semelhantes, onde os reads são marcados com cores diferentes para facilitar a visualização das alterações.

• O programa permite capturar imagens das alterações identificadas durante a análise.

Utilização da Versão Web do Programa

• A versão web do programa é semelhante à versão instalada e pode ser utilizada quando não há possibilidade de instalação local.

• É necessário selecionar simultaneamente as opções "Ban" e "Buy" para importar arquivos corretamente no sistema.