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Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification
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Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Preparação de Células T CD4 Positivas Usando Kits de Biotecnologia

Introdução ao Magnetismo e Separação Celular

  • Melanie Matthew apresenta o uso do magnetismo para a separação de células, destacando os imãs Max Mini e Midi Max, que são utilizados em diferentes volumes de células.
  • O Midi Max é adequado para separações maiores, permitindo processar até 10^9 células, enquanto o Mini Max é usado para volumes menores.

Processo de Seleção Negativa

  • Na seleção negativa, as células-alvo passam pela coluna e o eluído contém as células desejadas.
  • É importante realizar o procedimento em um ambiente estéril se as células forem utilizadas para cultura celular.

Preparação das Células

  • A preparação começa com a remoção dos linfonodos do camundongo, que são triturados em uma suspensão celular única usando um filtro de 70 micrômetros.
  • A trituração deve ser feita cuidadosamente para evitar aglomerados celulares; a suspensão resultante será utilizada na purificação das células T CD4 positivas.

Lise de Células Vermelhas do Sangue

  • Após centrifugar a suspensão celular, realiza-se a lise das células vermelhas do sangue (RBC), diminuindo a osmolaridade da solução.
  • A adição rápida de água seguida por uma solução 10x DBPS é crucial para evitar a lise das linfócitos durante o processo.

Seleção Negativa Final

  • Após contar as células no hemocitômetro, inicia-se a seleção negativa utilizando um kit específico para as células T CD4 positivas.
  • As células são rotuladas com biotina e um coquetel anticorpos antes da incubação em refrigerador por 10 minutos.

Procedimento de Purificação de Células T CD4+

Preparação da Coluna e Incubação

  • A coluna deve ser preparada para drenar completamente o tampão Max antes da adição das células, garantindo que a tensão superficial do líquido mantenha a coluna úmida.
  • Após uma incubação de 15 minutos com as esferas magnéticas antibiotina, as células são centrifugadas junto com o tampão Max, preparando-as para resuspensão.

Adição das Células à Coluna

  • As células devem ser resuspendidas em um volume apropriado conforme o protocolo de melatonina antes de serem aplicadas na coluna rinsada.
  • Como se trata de uma coluna de seleção negativa, as células que fluem através dela devem ser todas células T CD4 positivas.

Lavagem e Análise das Células

  • A coluna é lavada com 12 ml do tampão Max, coletando-se a alutina que deve conter apenas as células T CD4 positivas.
  • As células T CD4 positivas são centrifugadas novamente, resuspendidas e rotuladas com um corante apropriado para imagem em dois fótons. Uma amostra pequena é marcada com anti-CD3 e anti-CD4 para garantir a pureza da população celular.
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Reference: https://app.jove.com/v/409/isolation-cd4-t-cells-from-mouse-lymph-nodes-using-miltenyi-macs The process of isolating CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification involves several steps. First, the lymph nodes are harvested from the mouse and processed to obtain a single-cell suspension. The suspension is then incubated with CD4-specific antibodies conjugated to magnetic beads. These beads bind specifically to the CD4+ T cells. The suspension is then passed through a magnetic column, which retains the CD4+ T cells while allowing other cells to flow through. The retained CD4+ T cells are then eluted from the column, resulting in a highly purified population of CD4+ T cells ready for further analysis or experimentation. This method allows for the isolation of CD4+ T cells with high purity and yield, making it a valuable tool for immunological research. Additionally, the Miltenyi MACS purification system offers the advantage of being quick and easy to use, with minimal hands-on time and no need for expensive equipment. This makes it a convenient and efficient method for researchers working with mouse models to study immune responses, autoimmune diseases, and other immunological processes. The isolated CD4+ T cells can be used for a variety of downstream applications, such as flow cytometry, cell culture, functional assays, and gene expression analysis. Overall, the Miltenyi MACS purification system provides a reliable and effective way to obtain pure populations of CD4+ T cells for in-depth immunological studies. Furthermore, the Miltenyi MACS purification system is highly customizable, allowing researchers to tailor the purification process to their specific experimental needs. This flexibility enables researchers to isolate CD4+ T cells from various sources, including blood, lymph nodes, and spleen, with high purity and yield. The system also offers the option to isolate different subsets of CD4+ T cells based on specific surface markers, providing researchers with the ability to study distinct populations of T cells in their experiments. In addition, the Miltenyi MACS purification system is compatible with a wide range of antibodies and reagents, allowing for seamless integration into existing experimental workflows. This compatibility ensures that researchers can easily incorporate the system into their studies without the need for extensive optimization or revalidation.